彭樹英，李 俊，萬勝豪，汪 敏，汪 玲，汪承巧，韓蒙蒙，汪雨晨，耿雪俠，張海軍①

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北235000）

0 引言

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）為麥角菌科（Clavicipitaceae）冬蟲夏草菌（Ophiocordyceps sinensis（Berk.）G．H．Sung et al.（Cordyceps sinensis Berk.））寄生在蝠蛾屬（Hepialus）昆蟲幼蟲上長(zhǎng)出的子座及幼蟲尸體所形成的蟲菌復(fù)合體［1～3］. 感染此種真菌的昆蟲幼蟲在冬天形成致密的菌核即“冬蟲”，至次年春末夏初之際蟲體頭部長(zhǎng)出子座破土而出，即“夏草”［1-3］. 冬蟲夏草是一種極為珍貴的中藥材，具有補(bǔ)肺益腎［4］、止咳化痰、調(diào)節(jié)免疫力［5］、降血糖降血脂［6-7］、抗腫瘤［8］、抗氧化［9］和抗衰老［10］等多種功效. 冬蟲夏草寄主昆蟲的地理分布雖較獨(dú)特，但有其特定規(guī)律，主要分布于青海、西藏、四川、云南和甘肅五省境內(nèi)海拔3 000 m以上的青藏高原高寒草甸區(qū)［11］. 冬蟲夏草菌主要寄主昆蟲為蝠蛾屬昆蟲，根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分析，中國(guó)境內(nèi)記錄的蝠蛾屬昆蟲累計(jì)達(dá)到六十多種，據(jù)推測(cè)，未發(fā)現(xiàn)的種類可能會(huì)更多［12-13］. 1968年，Viette［14］以雄性生殖器抱器瓣底部明顯的突起為依據(jù)，在蝙蝠蛾科下建立鉤蝠蛾屬（Thitarodes）. 隨后，國(guó)外學(xué)者［15～17］將大部分蝠蛾種類歸于此屬. 由于昆蟲形態(tài)變化的可塑性及趨同進(jìn)化導(dǎo)致傳統(tǒng)分類法不夠準(zhǔn)確［18］，而且對(duì)冬蟲夏草寄主的研究也多側(cè)重于形態(tài)特征、生物學(xué)特性分析，或蝠蛾屬昆蟲的種類和地理分布的研究［19～25］，對(duì)我國(guó)不同產(chǎn)地冬蟲夏草寄主昆蟲之間的分子遺傳進(jìn)化關(guān)系的研究報(bào)道也較少，這將直接影響冬蟲夏草種質(zhì)資源的保護(hù)和有效利用［12］.

線粒體DNA（mtDNA）為雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無組織特異性、嚴(yán)格遵守母系遺傳、不易發(fā)生重組、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)［11］. mtDNA是研究動(dòng)物遺傳多樣性和分子進(jìn)化的有效標(biāo)記，已廣泛用于昆蟲分類和分子系統(tǒng)學(xué)的研究. 一些學(xué)者嘗試將形態(tài)分類方法和分子生物學(xué)方法結(jié)合，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足. 陳永久等［26］曾利用線粒體細(xì)胞色素b 基因（Cytochrome b，Cyt b）序列首次分析5 種冬蟲夏草寄主蝠蛾的分子進(jìn)化關(guān)系. 程舟等［12］通過對(duì)冬蟲夏草寄主蝠蛾的線粒體Cyt b基因片段的序列分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，分析我國(guó)冬蟲夏草寄主蝠蛾種屬的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和地域分布格局. 鄒志文等［13，18］以蝠蛾雄性生殖器抱器瓣結(jié)構(gòu)特征為依據(jù)，修訂現(xiàn)行中國(guó)蝠蛾屬昆蟲分類系統(tǒng)，將中國(guó)蝠蛾屬的62個(gè)種分別歸入擬蝠蛾屬（Parahepialus）、蝠蛾屬（Hepialus）、鉤蝠蛾屬（Thitarodes）及無鉤蝠蛾屬（Ahamus）等4個(gè)屬中，同時(shí)利用26 種原蝠蛾屬種類Cyt b基因片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，證明將蝠蛾雄性抱器瓣特征作為分屬依據(jù)是合理可信的. 陳抒云等［27］對(duì)冬蟲夏草和其它蟲草等物種的寄主昆蟲分別通過COⅠ基因和Cyt b 基因進(jìn)行條形碼分析，表明COⅠ序列更適用于蟲草寄主昆蟲的DNA 條形碼研究. 近幾年，一些學(xué)者為深入研究蟲草寄主蝠蛾的分子進(jìn)化及其分類，已相繼測(cè)定多條蟲草寄主蝠蛾mtDNA全基因組序列［11，18，28～31］.

作為分子標(biāo)記，研究動(dòng)物進(jìn)化的mtDNA應(yīng)用最多的是Cyt b，細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ），NADH脫氫酶亞基（ND4），12S rRNA基因，A+T富集區(qū)，腺苷三磷酸酶（ATP6或ATP8）等［32］. 16S rRNA基因亦是線粒體基因組中研究較多的基因，既含有保守序列，又含有與進(jìn)化距離相適應(yīng)的可變序列，被稱為進(jìn)化分子鐘［32］. 16S rRNA基因用于評(píng)價(jià)生物的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的報(bào)道很多［33～38］，但在冬蟲夏草寄主蝠蛾方面的研究尚未見報(bào)道. 本研究運(yùn)用線粒體16S rRNA基因序列對(duì)不同蟲草寄主蝠蛾的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步的遺傳系統(tǒng)進(jìn)化分析、種質(zhì)鑒定和資源保護(hù)奠定理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 基因序列來源

目前已登錄至GenBank的蝠蛾科線粒體基因組全序列共有11條記錄，其中7條為蟲草寄主蝠蛾（其中6種蝠蛾基因序列有兩個(gè)序列號(hào)），亞香棒蟲草寄主蝠蛾1條，其他蝠蛾3條（其中2種蝠蛾基因序列有兩個(gè)序列號(hào)），從GenBank中獲取并下載蝠蛾科、其他科蛾類及果蠅（外群）線粒體16S rRNA和COⅠ基因序列（表1）.

表1 本研究序列來源及信息

表1（續(xù)）

1.2 數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)進(jìn)化分析

將從NCBI 中獲取的序列保存為Fasta 格式，用ClustalX 2.1 軟件進(jìn)行序列對(duì)比. 然后將比對(duì)序列用MEGA 7.0軟件統(tǒng)計(jì)不同蝠蛾科16S rRNA基因序列間的簡(jiǎn)約位點(diǎn)、可變位點(diǎn)、保守位點(diǎn)以及種間遺傳間距，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹. 用DAMBE軟件分析基因序列的堿基組成，并分析AT或GC偏斜性，計(jì)算公式為AT-skew=［A-T］/［A+T］和GC-skew=［G-C］/［G+C］［39］. 本研究基于冬蟲夏草、亞香棒蟲草的寄主昆蟲（蝠蛾類）及其他蛾類的16S rRNA基因用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹. 為評(píng)估16S rRNA基因作為分類依據(jù)分子標(biāo)記的可靠性，同時(shí)用相同物種線粒體基因組序列的16S rRNA 聯(lián)合COⅠ基因構(gòu)建ML 系統(tǒng)進(jìn)化樹. 將系統(tǒng)進(jìn)化樹中bootstrap自檢值設(shè)置為1 000.

2 結(jié)果

2.1 序列堿基組成分析

將16S rRNA 基因序列進(jìn)行對(duì)比排列后，長(zhǎng)度為1 411 bp，其中保守位點(diǎn)1 054個(gè)，簡(jiǎn)約位點(diǎn)143個(gè)，可變位點(diǎn)310個(gè). 通過計(jì)算可知，A、C、G、T堿基的平均含量分別為44.1%、5.3%、9.6%、40.0%. A+T的平均含量為85.0%，明顯高于G+C 含量（15%）. 由表2 可知，AT 和GC 的偏斜度均為正值且小于1，最小ATSkew值為0.005（T.sylvina），最大AT-Skew值為0.045（A.yunnanensis），最小GC-Skew值為0.26（T.sp.），最大GC-Skew值為0.326（H.xiaojinensis），說明11種蝠蛾堿基組成對(duì)AT顯著偏移.

表2 11種蝠蛾的16S rRNA基因堿基組成

2.2 蝠蛾科11種蝠蛾的種間遺傳距離

由表3可知，在11種蝠蛾中，種間遺傳距離范圍在0.005～0.117之間，人支蝠蛾（T.renzhiensis）與阿爾泰蝠蛾（T.sp.）和貢嘎蝠蛾（T.gonggaensis）的種間遺傳距離為最?。?.005），T.sylvina與蒲氏鉤蝠蛾（T.pui）間的遺傳距離是最大（0.117）. 蟲草寄主蝠蛾間的遺傳距離為0.005～0.51.T.sylvina與其他蝠蛾的遺傳距離范圍在0.099～0.117，相比其他蝠蛾間的遺傳距離明顯偏大.

表3 11種蝠蛾16S rRNA基因的遺傳距離

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于16S rRNA基因和COⅠ基因聯(lián)合16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹均明顯分為兩個(gè)大分支. 在NJ樹（如圖1）中第Ⅰ支由蝠蛾科昆蟲包括蟲草寄主蝠蛾及其他蝠蛾構(gòu)成. 在蟲草寄主蝠蛾中，人支蝠蛾（T.renzhiensis）與阿爾泰蝠蛾（T.sp.）聚為一支，與貢嘎蝠蛾（T.gonggaensis）及小金蝠蛾（H.xiaojinensis）聚成一簇，與色季拉山蝠蛾（T.sejilaensis）與蒲氏鉤蝠蛾（T.pui）聚成的一支構(gòu)成姊妹群. 云南蝠蛾（A.yunnanensis）位于此支系的基部（自展值100%）. 7種蟲草寄主蝠蛾構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的大支系（自展值為100%），表明屬間親緣關(guān)系較近. 如蝠蛾屬的兩種蝠蛾（Endoclita signifer和Endoclita minanus）單獨(dú)聚類在一起，與湖南棒蝠蛾（N.hunanensis）和Triodia sylvina位于蟲草寄主蝠蛾類群的基部. 而在ML樹中（如圖2），蟲草寄主蝠蛾聚類與NJ樹中一致，但非蟲草寄主蝠蛾中N.hunanensis與T.sylvina單獨(dú)形成一個(gè)支系，E.signifer和E.minanus聚類形成另一個(gè)單獨(dú)支系. 兩種樹中第Ⅱ大支均由蠶蛾科、織蛾科、菜蛾科、卷蛾科、舉肢蛾科和麥蛾科蛾類構(gòu)成，NJ 樹中蠶蛾科的家蠶Bombyx mori與Bombyx huttoni聚類形成一支，然后與菜蛾（Plutella xylostella）和卷蛾（Spilonota lechriaspis）形成一支. 舉肢蛾科、織蛾科和麥蛾科聚類形成另一支.ML樹中的第Ⅱ大支稍有不同，蠶蛾科單獨(dú)聚類成一支，菜蛾（Plutella xylostella）和卷蛾（Spilonota lechriaspis）也聚類成一支，其余科的蛾類均單獨(dú)形成一支（如圖1和圖2）.

圖1 基于線粒體16S rRNA基因構(gòu)建的NJ樹

圖2 基于16S+COⅠ基因構(gòu)建的ML樹

3 討論

16S rRNA基因之所以成為常用的線粒體分子標(biāo)記，主要原因有如下幾點(diǎn)：一是該基因存在于所有昆蟲的體內(nèi)；二是16S rRNA 基因的保守性和特異性比較高［37］；三是該基因序列較長(zhǎng)，約含有50 個(gè)功能域［37］. COⅠ基因在線粒體DNA中分布普遍，具有多態(tài)性較高、基因進(jìn)化速率適中、適于通用引物擴(kuò)增等特點(diǎn)，是昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究中較為理想的分子標(biāo)記，該基因近年來在昆蟲的群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化方面有較多的研究［40］. 因此，在本研究中同時(shí)用蟲草寄主蝠蛾16S rRNA基因聯(lián)合COⅠ全基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以驗(yàn)證16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的可靠性和有效性.

通過對(duì)蝠蛾科蝠蛾線粒體16S rRNA 基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明：序列中A+T 的平均含量為85.0%，G+C的平均含量為15.0%，堿基組成對(duì)A+T表現(xiàn)為顯著的偏移. 種間的最小遺傳距離為0.005（T.renzhiensis與T.sp.，T.renzhiensis與T.gonggaensis），說明三者的親緣關(guān)系較其他蛾類更近. 將蟲草寄主蝠蛾、其他蝠蛾及其他科蛾類的16S rRNA 基因全序列約1 400 bp個(gè)堿基作為系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析位點(diǎn). NJ系統(tǒng)樹明顯分為2大支（圖1所示）：第Ⅰ支由蝠蛾科昆蟲包括蟲草寄主蝠蛾及其他蝠蛾，7種蟲草寄主蝠蛾最先聚為一支，其中人支蝠蛾（T.renzhiensis）、阿爾泰蝠蛾（T.sp.）與貢嘎蝠蛾（T.gonggaensis）同屬鉤蝠蛾屬聚為一簇（種間遺傳距離最小），小金蝠蛾（H.xiaojinensis）與3種鉤蝠蛾屬蝠蛾形成一個(gè)支系，說明小金蝠蛾（H.xiaojinensis）應(yīng)為鉤蝠蛾屬，這一結(jié)果印證并支持Kang［11］等的研究結(jié)論. 這一支系與色季拉山蝠蛾（T.sejilaensis）和蒲氏鉤蝠蛾（T.pui）形成的聚類簇互為姊妹群，而云南蝠蛾（A.yunnanensis）屬無鉤蝠蛾屬，獨(dú)立成一支. 以上結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道［11，18，29］所得結(jié)論一致. 同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟲草寄主蝠蛾分布地域較近的也更趨于歸為一類，如蒲氏鉤蝠蛾（T.pui）和貢嘎蝠蛾（T.gonggaensis）均分布于西藏林芝地區(qū). 湖南棒蝠蛾（N.hunanensis）是亞香棒蟲草的寄主昆蟲，并不是冬蟲夏草的寄主昆蟲，但兩種蟲草形態(tài)卻極為相似，說明兩種蟲草寄主蝠蛾可能具有較近的親緣關(guān)系. 進(jìn)化樹分析結(jié)果亦表明，在非蟲草寄主蝠蛾中湖南棒蝠蛾（N.hunanensis）的確是與所有冬蟲夏草寄主蝠蛾關(guān)系較近的一支，而其他蝠蛾與蟲草寄主蝠蛾關(guān)系明顯稍遠(yuǎn)一些. 本研究分析蟲草寄主蝠蛾間的進(jìn)化關(guān)系而得出的結(jié)論與Zou等［18］和Kang等［11］的觀點(diǎn)基本一致. 本研究同時(shí)也用來源于相同物種線粒體基因組的COⅠ基因聯(lián)合16S rRNA構(gòu)建ML進(jìn)化樹（圖2所示），與單獨(dú)用16S rRNA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果相符，在一定程度上支持鄒志文等［13］提出形態(tài)學(xué)分類的觀點(diǎn)，即將蝠蛾屬以雄性生殖器抱器瓣結(jié)構(gòu)特征為依據(jù)分為4個(gè)屬的合理性. 這也說明16S rRNA基因可以進(jìn)行科屬級(jí)分類，作為系統(tǒng)進(jìn)化分析和分類的標(biāo)記基因是有效且可信的.

本研究中樣本數(shù)有所欠缺，分布區(qū)域不均，因此今后研究過程中為更全面具體地進(jìn)行系統(tǒng)分類，還需要增加種群數(shù)量并結(jié)合其他分析技術(shù)手段，從而為蟲草寄主昆蟲的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供更全面的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為藥用蟲草資源的保護(hù)和利用奠定理論依據(jù).