王靜雅，尚雪瑩，李夢雨，馬 紅，常 芳

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438)

被子植物又稱為開花植物，其物種數(shù)目能占全球總數(shù)的67%，重要的原因除了被子植物的雙受精機(jī)制以外，還因為其能夠適應(yīng)復(fù)雜的外界環(huán)境.近年的多項研究報道了生長素、油菜素甾醇、甲基茉莉酸等植物激素信號以及高溫、干旱等非生物信號均對花藥發(fā)育產(chǎn)生重要影響.研究植物對環(huán)境信號的響應(yīng)能夠豐富植物生長與生殖過程的信號網(wǎng)絡(luò)，為農(nóng)作物的分子改良提供重要的理論指導(dǎo)，對于植物的繁衍生息、物種多樣性的保護(hù)以及農(nóng)作物的增產(chǎn)都具有至關(guān)重要的意義.

花藥是被子植物的雄性生殖器官，其正常發(fā)育與否直接影響植物繁衍和作物產(chǎn)量.目前依賴于細(xì)胞生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等手段進(jìn)行的研究已經(jīng)明確，花藥發(fā)育過程包括早期的形態(tài)建成、減數(shù)分裂和后期的花粉粒發(fā)育幾個階段[1-2].擬南芥的花藥發(fā)育過程能夠分為14個時期，在第5期花藥完成形態(tài)建成，形成具有4個藥室的典型結(jié)構(gòu)，且每個藥室都由4層體細(xì)胞(從外到內(nèi)分別為表皮層、內(nèi)皮層、中間層以及絨氈層)包圍中央的花粉母細(xì)胞構(gòu)成；花粉母細(xì)胞在第6期進(jìn)行減數(shù)分裂并于第7期形成四分體；此后包圍四分體的胼胝質(zhì)被降解、小孢子被釋放到藥室中，最終發(fā)育成為成熟花粉粒并于第13期被釋放出來[2-3].這一過程中，絨氈層的正常發(fā)育和降解對花藥發(fā)育至關(guān)重要，其能夠分泌胼胝質(zhì)酶促進(jìn)胼胝質(zhì)降解、合成孢粉素前體用于花粉壁合成、同時也為小孢子后期發(fā)育提供必要的營養(yǎng)和脂類物質(zhì)[4-7].在花藥發(fā)育過程中存在多層次信號途徑協(xié)調(diào)互作，以實(shí)現(xiàn)對植物生命活動復(fù)雜而精確的調(diào)控，例如受體激酶BAM1/2、ER/ERL1/ERL2參與調(diào)控藥室發(fā)育及生殖細(xì)胞與體細(xì)胞的分化[8-10]；受體樣蛋白激酶EMS1-SERKs-TPD1組成的受體-配基復(fù)合物參與調(diào)控絨氈層的形成[11-15]；DYT1-MYB35/TDF1-AMS-MS1遺傳通路調(diào)控絨氈層發(fā)育及功能[16-18]；多肽激素CLE19及其冗余家族成員在花粉外壁形成過程中發(fā)揮重要作用[19].同時，高溫、干旱等環(huán)境信號也是影響植物育性的重要因素[20-22].

光是重要的環(huán)境信號，能夠引發(fā)植物的光形態(tài)建成以及調(diào)控植物的多個生長發(fā)育過程[23].光信號的缺乏或?qū)庑盘栱憫?yīng)的缺陷會導(dǎo)致植物的形態(tài)出現(xiàn)異常.植物破土前在黑暗環(huán)境下處于暗形態(tài)發(fā)生時期，下胚軸會不斷伸長，葉片的生長受到抑制；而當(dāng)幼苗暴露在陽光下后能夠響應(yīng)光信號，完成光形態(tài)建成，在此過程中葉片不斷生長發(fā)育，而下胚軸生長則受到抑制.B類基因(class B genes)是一類特殊的、與擬南芥生長相關(guān)的基因，在黑暗條件下，轉(zhuǎn)錄因子PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs(PIFs)不斷積累，并能夠通過激活B類基因的表達(dá)從而促進(jìn)下胚軸的伸長；而在光照條件下，光敏色素Phytochromes(phys)則能夠通過促進(jìn)PIFs的降解以抑制其功能，從而完成光形態(tài)建成過程[24-27].近年的研究表明，光信號能夠影響植物的開花時間，且光溫敏核不育小麥的花藥發(fā)育也會受到光周期的影響[28-29].但目前對于光信號調(diào)控雄性育性的分子機(jī)制尚不清楚.本實(shí)驗室前期利用轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)有752個光信號途徑相關(guān)基因在擬南芥4～7期花藥中表達(dá),暗示這些基因可能在花藥發(fā)育中發(fā)揮功能[30].

HEMERA(HMR)基因編碼一個光敏色素信號途徑中的關(guān)鍵元件，已經(jīng)被報道參與調(diào)控擬南芥光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在光形態(tài)建成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31-33].hmr-5為擬南芥的功能完全缺失突變體，其HMR的N端突變導(dǎo)致翻譯提前終止[34].已有研究證實(shí)hmr-5的光信號的響應(yīng)缺陷會導(dǎo)致其葉片出現(xiàn)白化癥狀且下胚軸持續(xù)伸長，幼苗在光照條件下無法完成光形態(tài)建成過程[35].使用35S啟動子驅(qū)動HMR-HA蛋白在hmr-5突變體背景下過表達(dá)，能夠恢復(fù)hmr-5的功能缺陷.此外，HMR蛋白的C端有一段9個氨基酸的序列(9aa TAD)，可能決定了HMR的轉(zhuǎn)錄激活功能[36]，該區(qū)域定點(diǎn)突變植株hmr-22(D516N)幼苗的生長也出現(xiàn)一定程度的損害，其對紅光和遠(yuǎn)紅光的響應(yīng)程度降低，但對藍(lán)光具有正常的響應(yīng)[35].進(jìn)一步的分子機(jī)制研究揭示HMR的功能缺失會導(dǎo)致PIFs蛋白的降解過程受阻，且PIFs下游B類基因的表達(dá)激活出現(xiàn)異常[31,35].在光照條件下，HMR是PIF蛋白降解過程所必需的，一方面HMR的N端能夠直接與轉(zhuǎn)錄因子PIF1、PIF3結(jié)合，和phys一起介導(dǎo)PIFs的降解過程，最終抑制下胚軸的伸長；另一方面HMR蛋白的C端則通過招募或穩(wěn)定由基本轉(zhuǎn)錄因子(General Transcription Factors, GTFs)、中介體復(fù)合物(mediator complex)與RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ RNA polymerase)組成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體來促進(jìn)PIFs下游B類基因的轉(zhuǎn)錄激活，最終促進(jìn)下胚軸的伸長[35].但HMR是否參與到雄蕊發(fā)育過程，目前尚未見報道.

基于此，本文以HMR轉(zhuǎn)錄激活能力下降的點(diǎn)突變體hmr-22和轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系HMR-HA/hmr為材料，分析了HMR在雄蕊發(fā)育過程中可能發(fā)揮的功能，為深入闡明光信號途徑調(diào)控植物雄性育性的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞生態(tài)型(Columbia)，野生型為Columbia-0(Col-0).突變體包括點(diǎn)突變體hmr-22和轉(zhuǎn)基因植株HMR-HA/hmr[34-35].

1.2 方法

1.2.1 擬南芥突變體DNA的提取與基因型鑒定

采新鮮的擬南芥葉片，使用CTAB法提取其基因組DNA[37].基因型鑒定使用引物見表1，擴(kuò)增后選取電泳條帶清晰明亮的樣品使用NanoDrop超微量紫外分光光度計測量其DNA濃度，將達(dá)到要求的樣品送至公司測序.測序結(jié)果使用擬南芥TAIR網(wǎng)站(www.arabidopsis.org)的BLAST功能進(jìn)行比對分析.

表1 實(shí)驗用引物信息Tab.1 Primers used in experiment

1.2.2 亞歷山大紅染色觀察

取剛剛露白的花朵(約為花藥發(fā)育的11～12期)浸泡于卡諾固定液中于4℃保存.觀察時，在體視顯微鏡(Motic Discovery.V8)下剝掉花瓣及花萼后放置于亞歷山大紅染液(Solarbio G3050)中，65℃染色20min后取出，放置于載玻片上，使用解剖針尖分離花藥，注意不要弄破花藥，制片后放置在顯微鏡(Zeiss Axio Scope A1)下觀察花藥的大小和花藥中花粉粒的活性并拍照.

1.2.3 花序樹脂包埋

摘取擬南芥新鮮植株的花序，將開放的花朵去除，放入裝有FAA固定液的青霉素小瓶中，抽兩次真空至花序沉底，后放置于4℃冰箱保存過夜.在小瓶中依次換入濃度為70%、80%、90%、95%的乙醇溶液分別脫水處理1h，后換入100%的乙醇處理2h，再使用加入伊紅染料的100%乙醇處理2h使花序著色；在小瓶中換入預(yù)滲透液(無水乙醇與Base liquid Technovit 7100等體積混勻)中進(jìn)行1h的預(yù)滲透處理，換入滲透液(1g硬化劑1溶于100mL Base liquid Technovit 7100)中滲透3h.將1mL硬化劑2添加到15mL滲透液后分裝入包埋板中并將花序放入包埋板中擺正，放置于65℃烘箱中烘烤36h以上直至樣品完全變硬.

1.2.4 半薄切片及染色

使用LEICA RM2265型全自動電動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，檢查其工作狀態(tài)，將烘烤完成的包埋塊從包埋板中取出并安裝到LEICA RM2245型切片機(jī)上，制備玻璃刀，調(diào)整刀口與包埋塊之間的位置與角度后開始切片，切片厚度為1.0μm.在載玻片中央滴加蒸餾水，放置于42℃的烘片臺上，使用鑷子和針尖將切好的切片從刀口轉(zhuǎn)移到載玻片上.等待切片平展開至沒有褶皺，用吸水紙輕輕吸去多余水分，將載玻片放置于65℃烘箱內(nèi)烘干.將載玻片放入裝有1%甲苯胺藍(lán)染色液的玻璃染缸中染色1min左右，用蒸餾水沖洗干凈后蓋上蓋玻片放置于顯微鏡(Zeiss Axio Scope A1)下觀察并拍照.

1.2.5 花粉體外萌發(fā)實(shí)驗

配置花粉體外萌發(fā)培養(yǎng)基，加入瓊脂后加熱，用移液槍趁熱將培養(yǎng)基滴入凹面載玻片中.摘取露白花苞，除去花瓣和雌蕊，輕輕將雄蕊沾在培養(yǎng)基上.將載玻片放置于濕盒中，濕盒底層加蒸餾水.放置于22℃避光培養(yǎng)4～8h后使用顯微鏡(Zeiss Axio Scope A1)觀察，統(tǒng)計萌發(fā)的花粉比例.

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果

為了了解HMR是否可能在生殖發(fā)育過程中發(fā)揮功能，我們首先分析了HMR在不同營養(yǎng)和生殖階段的表達(dá)情況.The Bio-Analytic Resource for Plant Biology公共數(shù)據(jù)庫(http: ∥bar.utoronto.ca/)中的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在23個營養(yǎng)器官中，HMR主要在莖尖和蓮座葉等器官中具有比較高的表達(dá)水平(圖1(a))；而在生殖過程中，HMR在莖尖分生組織、花序、第9期的花、第10～11期的花、第12期的花中呈現(xiàn)高水平表達(dá)(圖1(b))，表明HMR在這些過程可能發(fā)揮重要作用.

繼而，我們依據(jù)本課題組及其他課題組已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[22,38-39]，著重分析了該基因在雄性生殖發(fā)育相關(guān)組織器官中的表達(dá).結(jié)果表明HMR在第1～9期的花(Early Flowers)、第10～12期的花(Late Flowers)、第4～7期的花藥(Anther 4～7)、第4～10期的花藥(Anther 4～10)中都有較高水平的表達(dá)(圖1(c))，暗示其在花藥發(fā)育過程中可能發(fā)揮功能.此外，為了明確HMR是否在CLE19、AMS、BAM3、BES1、DYT1、bHLH010/089/091這些花藥發(fā)育核心調(diào)控元件的下游發(fā)揮功能，我們還基于本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了HMR在這些相關(guān)單突變體、雙突變體和三突變體花藥轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)變化情況[40-41](本課題組部分轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)尚未發(fā)表).結(jié)果表明HMR在上述相關(guān)突變體中的表達(dá)變化幅度都不超過2倍(圖1(d))，暗示其RNA表達(dá)水平不受這些基因的調(diào)控.

2.2 hmr-22純合植株的鑒定與序列比對

為了保證所使用的突變體為純合植株，我們首先對植株進(jìn)行了基因型鑒定，對突變體和野生型植株提取基因組后，使用表1中的引物進(jìn)行擴(kuò)增并送測序，使用TAIR網(wǎng)站的BLAST功能比較突變體與野生型植株HMR基因序列的差別，確認(rèn)點(diǎn)突變位置(D516N)，且測序峰圖中突變位置對應(yīng)的峰為清晰的單峰，說明突變體為純合hmr-22植株，可以用于后續(xù)研究.

2.3 植株形態(tài)與育性分析

我們觀察了WT、hmr-22純合突變體及35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)植株HMR-HA/hmr的生殖發(fā)育情況(圖2(a)).野生型的植株生長正常，能夠形成較多飽滿的長角果；相比之下，hmr-22純合突變體抽苔時間顯著更晚，植株更矮、果莢短；而轉(zhuǎn)基因恢復(fù)植株HMR-HA/hmr果莢的大小和育性與野生型無明顯差異.進(jìn)而，我們分別統(tǒng)計了野生型、hmr-22、HMR-HA/hmr3種基因型植株主苔的平均果莢數(shù)以及每個果莢內(nèi)產(chǎn)生的種子數(shù)目.結(jié)果表明: 和野生型及轉(zhuǎn)基因恢復(fù)植物相比，hmr-22突變體中產(chǎn)生的果莢數(shù)目以及每個果莢中的種子數(shù)目均顯著減少(圖2(b)、(c)).以上結(jié)果說明HMR對于植物的營養(yǎng)生長過程與生殖生長過程均有較大影響，且HMR功能缺失導(dǎo)致植株育性下降，暗示它在生殖發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用.

2.4 花藥亞歷山大紅染色觀察花粉粒活性

為了明確HMR基因是否在花藥發(fā)育過程中發(fā)揮作用，我們對突變體的花藥進(jìn)行了亞歷山大紅染色，通過觀察花藥的形態(tài)、花粉粒的數(shù)量以及花粉粒的活性進(jìn)一步明確hmr-22的雄性生殖發(fā)育表型.染色結(jié)果顯示野生型花藥經(jīng)過染色后，4個飽含紅色活力成熟花粉粒的藥室清晰可見(圖3(a))，相比之下，hmr-22花藥雖然仍有正常的4藥室結(jié)構(gòu)，但花粉粒的數(shù)量與野生型相比有比較明顯的下降(圖3(b))；而在轉(zhuǎn)基因植株HMR-HA/hmr中花藥中的花粉數(shù)量與野生型相近，未見明顯異常(圖3(c)).以上結(jié)果表明hmr-22突變體的雄性發(fā)育過程存在缺陷，進(jìn)一步暗示了HMR可能參與調(diào)控花藥的發(fā)育過程.

2.5 半薄切片觀察突變體花藥細(xì)胞結(jié)構(gòu)

為了進(jìn)一步探究HMR在花藥發(fā)育中發(fā)揮功能的時期及細(xì)胞層，我們采用半薄切片的方法對突變體花藥的發(fā)育過程和組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示.野生型花藥在第5期時花藥形成了由外到內(nèi)的表皮層、內(nèi)皮層、中間層、絨氈層4層體細(xì)胞包圍著中央生殖細(xì)胞的典型形態(tài)特征(圖4(a))；在第7期花藥藥室中能清晰地看到小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成的由4個單核花粉粒形成的四分體(圖4(b))；第8期時小孢子從四分體內(nèi)釋放到花藥的藥室中(圖4(c)).相比而言，hmr-22的花藥發(fā)育表型在第8期之前與野生型基本一致，各個細(xì)胞層分化正常(圖4(f)、(g)、(h)).

花藥發(fā)育的后期為小孢子發(fā)育為花粉粒的階段，隨著花粉粒逐漸成熟，花絲不斷伸長以將花藥舉高，而提供營養(yǎng)物質(zhì)的絨氈層細(xì)胞則會在第10期開始發(fā)生程序性死亡而逐漸降解，至第12期降解完全(圖4(d)、(e)).半薄切片結(jié)果顯示，在這一發(fā)育階段hmr-22的花藥結(jié)構(gòu)與野生型相比出現(xiàn)了明顯的異常，野生型花藥的絨氈層細(xì)胞于第10～11期正常降解，而在hmr-22突變體中可觀察到絨氈層細(xì)胞的提前降解(圖4(i))，最終導(dǎo)致突變體第12期產(chǎn)生的花粉粒出現(xiàn)異常的空泡化而敗育(圖4(j)).而回補(bǔ)株系HMR-HA/hmr的切片結(jié)果顯示，其花藥發(fā)育過程正常，與野生型相比無較大差異(圖4(k)～(o)).同時，hmr-22突變體花粉在12期與野生型和轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系相比，花粉著色比較淺，且半數(shù)花粉空泡化，說明花粉發(fā)育及脂類物質(zhì)合成可能不足(圖4(j)).以上結(jié)果暗示HMR功能異常影響了花粉發(fā)育過程.

2.6 體外萌發(fā)實(shí)驗觀察花粉萌發(fā)率

亞歷山大紅染色及半薄切片結(jié)果均證明hmr-22突變體的花藥發(fā)育出現(xiàn)異常，導(dǎo)致敗育花粉的形成.但我們?nèi)匀豢梢杂^察到相當(dāng)數(shù)量形態(tài)、活力正常的花粉.但這些染色正常的花粉是否具有正常萌發(fā)的能力呢？因此我們?nèi)〉?3期開放的花，將其花粉粒鋪于固體萌發(fā)培養(yǎng)基上，進(jìn)行體外萌發(fā)實(shí)驗.多次重復(fù)的實(shí)驗結(jié)果顯示，野生型植株與HMR-HA/hmr轉(zhuǎn)基因的花粉粒體外萌發(fā)率接近50%，而hmr-22突變體花粉粒的萌發(fā)率則顯著降低至不足20%(圖3(d))，表明HMR基因功能異常影響了花粉活力和花粉萌發(fā)能力.這一結(jié)果和半薄切片中觀察到花粉著色淺及空泡化是吻合的.

3 討 論

雄蕊的正常發(fā)育是被子植物產(chǎn)生正?？捎ǚ哿５那疤?，也是植物正常完成雙受精作用而繁衍后代的基礎(chǔ)，探究其發(fā)育過程及調(diào)控機(jī)制對于生殖發(fā)育基礎(chǔ)理論研究及針對農(nóng)作物的遺傳改良都具有重要意義.之前在模式植物擬南芥和水稻中進(jìn)行的系列研究揭示了眾多調(diào)控雄性生殖發(fā)育的植物內(nèi)在調(diào)控基因以及環(huán)境因子，比如高溫、干旱等.不同于動物面對脅迫條件可以逃避，植物無法移動，只能通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑適應(yīng)外部環(huán)境、調(diào)控自身生長發(fā)育過程.因此探究植物生長發(fā)育過程中對環(huán)境信號的響應(yīng)是非常重要的.

植物的生長發(fā)育不僅受到遺傳物質(zhì)的控制，也受到各種環(huán)境信號的調(diào)節(jié)，因此，植物的發(fā)育過程需要各種復(fù)雜的信號通路之間存在多層次的協(xié)調(diào)作用，以感知環(huán)境信號，實(shí)現(xiàn)對植物生命活動復(fù)雜而精確的調(diào)控，維持植物生長、繁殖與抵抗逆境之間的平衡，使生命活動的效率達(dá)到最大化.因此，一個基因同時參與調(diào)控多個生物學(xué)過程，是重要而有意義的.在眾多的環(huán)境因素中，光信號對于植物的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用.一方面，光是植物的重要能量來源，另一方面，光也是調(diào)控包括生殖發(fā)育在內(nèi)的植物發(fā)育過程的重要信號，光周期極大地調(diào)控了擬南芥的開花過程.但是目前我們對于哪些基因參與了光信號對于植物生長發(fā)育的調(diào)控過程依然所知甚少，對于這些基因在生殖方面的功能更知之甚少.光信號通路的HEMERA(HMR)基因被報道在光敏色素介導(dǎo)的紅光/遠(yuǎn)紅光信號途徑中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，對植物的光形態(tài)建成具有重要意義.但其是否參與調(diào)控生殖發(fā)育尚不清楚.

本研究采用C端9aa TAD序列的點(diǎn)突變體hmr-22、野生型擬南芥Col-0以及轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系HMR-HA/hmr作為材料，通過對植株形態(tài)、果莢數(shù)量及長度、花藥育性、花藥發(fā)育過程、花粉萌發(fā)情況進(jìn)行細(xì)致觀察和統(tǒng)計分析，明確了HMR功能異常會影響植物的生殖發(fā)育過程，并且發(fā)現(xiàn)這種影響是由于花藥絨氈層的后期形態(tài)和功能、花粉發(fā)育以及花粉萌發(fā)力均出現(xiàn)異常的綜合結(jié)果.此前沒有光信號中光敏色素相關(guān)基因在植物生殖發(fā)育過程中的功能研究報道，本文首次證明了光敏色素B信號途徑重要組分HMR參與調(diào)控擬南芥雄性生殖發(fā)育的過程.這一研究不僅揭示了光敏色素途徑在調(diào)控植物雄性育性中的功能，也為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑奠定了基礎(chǔ).同時，這一方向的深入探究對于理解植物生殖發(fā)育的平衡以及指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義.