沈 潮，李超群，魏 珍，陳昕媛，余 巍

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

某些氨基酸代謝過程中產(chǎn)生的只含有一個碳原子的基團，稱為一碳單位(one carbon unit).通常一碳單位不能單獨游離，需要通過和葉酸化合物四氫葉酸(TetraHydroFolic acid, THF)結(jié)合來參與生物代謝[1].一碳單位代謝中的各種生物化學(xué)反應(yīng)均以循環(huán)的方式進行，在此過程中，一碳單位會轉(zhuǎn)移并參與到其他代謝途徑，并由其他來源進行補充.值得注意的是，針對葉酸代謝及其下游核苷酸代謝的抑制劑已在化療中應(yīng)用長達60多年，如今部分腫瘤治療仍會通過選擇葉酸的抑制劑來降低惡性細胞的增殖[2-3].

近年來，人們對腫瘤相關(guān)代謝機制的研究日益加深，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(Serine HydroxylMethyl Transferase, SHMT)作為一碳單位代謝和絲氨酸代謝通路中的關(guān)鍵酶之一，催化線粒體中THF和5,10-meTHF之間的轉(zhuǎn)換，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞代謝中發(fā)揮重要作用.SHMT在腫瘤病患體內(nèi)呈現(xiàn)異常高表達狀態(tài).SHMT存在兩個亞型，分別為蛋白SHMT1和SHMT2.其中，SHMT1負責(zé)編碼胞質(zhì)同工酶，參與了胸苷酸的從頭合成途徑[4]；SHMT2則負責(zé)編碼線粒體同工酶，參與了線粒體胸腺嘧啶核苷單磷酸酯(Deoxyadenosine Triphosphate, dTMP)的合成[5].

眾多臨床數(shù)據(jù)顯示，目前許多癌癥包括腎癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)癌癥中SHMT2蛋白表達增高，但SHMT1亞型蛋白表達量正常[6-7]，并且我們可以通過SHMT2的表達量確定腫瘤的生長狀況并預(yù)測預(yù)后[8-9].然而，SHMT2如何影響腫瘤細胞代謝和腫瘤增殖，機制尚不清楚.有報道指出，乳腺癌中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α, HIF-1α)和癌基因C-MYC的協(xié)同作用，上調(diào)病患體內(nèi)SHMT2蛋白的表達量，同時增強了氧化還原反應(yīng)，促進提升癌細胞在缺氧環(huán)境下的生存能力[7].

而在本文中我們發(fā)現(xiàn)，SHMT2能夠被SIRT5去琥珀?；揎?琥珀?；揎検切掳l(fā)現(xiàn)的一種蛋白翻譯后修飾，且近年來該研究領(lǐng)域發(fā)展迅速.SIRT5作為Sirtuins家族里的一員于1999年被Frye等首次發(fā)現(xiàn)[10]，它也是家族中第一個被發(fā)現(xiàn)除了NAD+依賴的去乙?；钚酝猓€具有水解賴氨酸上琥珀酰、丙二酰及戊二?；鶊F的能力[11].SIRT5蛋白大部分位于線粒體內(nèi)，且廣泛表達在胎兒或成人的心臟、肌肉、腦、腎臟、肝臟等組織中[12].該蛋白在人體內(nèi)的廣泛表達也暗示其對于線粒體蛋白的調(diào)控有著至關(guān)重要的作用.SHMT2也主要定位于線粒體，是線粒體內(nèi)的磷酸吡哆醛(Pyridoxal Phosphate, PLP)結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)其可以保護線粒體DNA，使其免受尿嘧啶積淀的影響[13].

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SIRT5能與SHMT2相互作用并調(diào)控其琥珀?；揎椗c酶活，且K181位賴氨酸為其主要的琥珀酰化位點.同時發(fā)現(xiàn)高濃度的甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)能通過抑制體內(nèi)SIRT5表達量上調(diào)SHMT2蛋白的琥珀?；揎棧种芐HMT2酶活，從而起到抑制癌細胞代謝的作用.

1 材料與方法

1.1 材料及相關(guān)試劑

HEK293T細胞株源于本實驗室，結(jié)直腸癌HCT116細胞株源于上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院，DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone公司，SIRT5和Succinylated-lysine抗體購自Cell Signaling Technology公司，SHMT2抗體購自Santa Cruz公司，KOD-plus定點突變試劑盒購自日本東洋紡公司，煙酰胺購自Sigma公司，甲氨蝶呤購自美國APExBIO公司，質(zhì)粒小抽試劑盒購自天根生物科技公司.

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

本實驗室采用PEI試劑進行轉(zhuǎn)染，以10cm培養(yǎng)皿的HEK293T細胞為例，當(dāng)細胞密度達到70%時即可進行轉(zhuǎn)染.在1.5mL小管中依次加入1mL DMEM培養(yǎng)基、5μg質(zhì)粒及15μL PEI，吹打混勻后，室溫靜置15min.將混合液均勻加入培養(yǎng)皿中，十字形晃動培養(yǎng)皿后，放入培養(yǎng)箱中孵育.6h后換液，48h后收樣處理.

1.3 免疫共沉淀

除盡細胞培養(yǎng)基后，4℃預(yù)冷PBS溶液洗滌3次.加入1mL 0.4%NP40裂解液，置于4℃水平搖床中慢速孵育20min.充分吹打裂解，收集裂解液于小管中，4℃，12000r/min，離心15min.取50μL上清液作陽性對照，加入10μL 6×SDS上樣緩沖液，95℃加熱8min，待用.在剩余上清液中加入10μL已偶聯(lián)抗體的磁珠，4℃旋轉(zhuǎn)2h后，4℃，2000r/min，離心2min，去上清.加入0.4%NP40裂解液，混勻后4℃，2000r/min，離心2min，重復(fù)3次.加入80μL 1×SDS上樣緩沖液，95℃加熱8min，待用.

1.4 免疫印跡法

配膠，上層膠濃度為5%，下層膠濃度為12%.加入電泳緩沖液后上樣，80V恒壓30min，將電壓調(diào)至120V電泳1.5h.300mmol/L恒流濕轉(zhuǎn)60min.用5%BSA(1×TBST)溶液室溫封閉1h.一抗孵育4℃搖床過夜或室溫搖床1h.回收一抗，1×TBST溶液洗膜，快搖5min，重復(fù)3次.加入相應(yīng)屬性二抗，室溫孵育1h.回收二抗，洗膜3次后進行顯影記錄.

1.5 SHMT2酶活檢測[14]

酶活反應(yīng)液配方: 50μmol/L PLP，25mmol/L Na2SO4，1mmol/L EDTA，50mmol/L DL-β-苯基絲氨酸，50mmol/L Hepes pH8.0.將野生型SHMT2及其突變體或者與SIRT5作用后的SHMT2加入上述反應(yīng)液中，置于96孔板中，檢測279nm處的信號強度.

1.6 統(tǒng)計分析

利用Graphpad Prism軟件統(tǒng)計樣本，并對結(jié)果進行雙尾t檢驗分析，最終以柱形圖的形式呈現(xiàn).其中，所有數(shù)據(jù)的處理都遵循SEM分析法(mean±SD).P<0.05被認為符合統(tǒng)計學(xué)意義，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001.

2 結(jié) 果

2.1 SIRT5能與SHMT2在體內(nèi)相互作用

首先，我們在pcDNA3.1b(-)載體上構(gòu)建帶有flag標(biāo)簽的SIRT5表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中.48h后，收集細胞并進行裂解收樣，使用Flag M2 beads進行免疫共沉淀實驗.實驗結(jié)果顯示，外轉(zhuǎn)Flag-SIRT5和內(nèi)源SHMT2存在明顯互作.同理，使用帶有Flag-SHMT2質(zhì)粒也被證明能和內(nèi)源SIRT5發(fā)生相互作用(圖1).

2.2 SHMT2可被SIRT5去琥珀酰化修飾，并降低酶活

由于SIRT5是去?；揎椕?，具備去琥珀?；ケ；腿ノ於；钚裕疫@些蛋白翻譯后修飾的過程是可逆的，煙酰胺(Nicotinamide, NAM)作為SIRT5去?；揎棶a(chǎn)物，能夠反饋抑制去酰化修飾的發(fā)生，故使用NAM處理細胞，以確定SHMT2能夠被?；揎?通過包裝慢病毒感染HEK293T細胞，我們構(gòu)建了表達Flag-SHMT2的穩(wěn)定細胞系.用500μmol/L NAM處理該穩(wěn)定株后發(fā)現(xiàn)，在8h內(nèi)，隨著時間的增加，SHMT2琥珀?；讲粩嗵岣撸；臀於；瘏s無明顯變化趨勢(圖2(a)).因此，確定SHMT2能夠被琥珀酰化修飾.

繼而，我們將Flag-SHMT2和HA-SIRT5共轉(zhuǎn)于HEK293T細胞中，經(jīng)Western blot驗證，SIRT5能去琥珀?；疭HMT2蛋白(圖2(c)).同時，為了驗證SHMT2蛋白的琥珀酰化對其酶活的影響，我們使用DL-β-苯基絲氨酸作為SHMT2酶活反應(yīng)底物檢測其酶活，發(fā)現(xiàn)NAM處理會降低SHMT2酶活性，而SIRT5則能顯著提升其酶活性(圖2(b，d)).這證明了SHMT2的琥珀酰化修飾會抑制本身的催化活性.

2.3 K181是SHMT2主要的琥珀?；揎椢稽c

為尋找SHMT2蛋白上的琥珀酰化修飾位點，通過檢索文獻中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)并比較不同物種之間的同源性，確定了最有可能的9個琥珀?；嚢彼嵝揎椢稽c，分別是K103，K181，K269，K302，K409，K459，K464，K469，K474等[15].利用NCBI網(wǎng)站進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)這預(yù)測的9個位點在人、牛、斑馬魚、鼠、黑猩猩等物種中的保守性較高(圖3(a)).

首先，為進一步確認SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位點，我們將這些位點上的賴氨酸K分別突變?yōu)楣劝彼酔(模擬琥珀酰化修飾)和精氨酸R(模擬去琥珀?；揎?，并檢測相應(yīng)突變蛋白的琥珀酰化修飾水平和酶活.實驗表明： 與野生型SHMT2蛋白相比，K181E突變蛋白的琥珀?；郊懊富罹@著降低(圖3(b)).雖然K269E，K302E，K469E等3個位點的琥珀?；揎椌兴抡{(diào)，但其相應(yīng)酶活卻顯著升高(圖3(b))，所以，綜上，我們初步確定K181位點是SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位點.

其次通過實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，SHMT2突變蛋白K181E及K181R的酶活在體外顯著性降低(圖3(c)).同時，在測定酶活的反應(yīng)液中分別加入HA-SIRT5或NAM，我們發(fā)現(xiàn)野生型的SHMT2蛋白酶活會分別顯著性地提升及降低，而K181E和K181R兩個突變蛋白的酶活卻基本沒有發(fā)生改變(圖3(c))，表明SHMT2的181位點突變之后，其酶活不再受SIRT5和NAM影響，進一步證明第181位賴氨酸是SHMT2的主要琥珀酰化修飾位點.值得注意的是，在加入SIRT5之后K181R酶活顯著降低(圖3(c))，這可能是SHMT2存在其他位點受SIRT5調(diào)控.K181E突變體酶活較低(～0.2)，故過表達SIRT5之后酶活無進一步的明顯變化；而K181R酶活較高(～0.5)，故對K181R的影響較大.

2.4 甲氨蝶呤影響SHMT2琥珀?；揎?/h3>

甲氨蝶呤(MTX)是一種臨床使用的化療藥物，作為葉酸拮抗劑，能有效抑制二氫葉酸還原酶，阻斷一碳代謝通路，抑制腫瘤的生長發(fā)育.我們采用結(jié)直腸癌細胞HCT116進行試驗，以便更好地觀察MTX在腫瘤細胞中能否通過調(diào)控SHMT2蛋白的琥珀酰化阻斷腫瘤細胞的生長.

我們分別按照0，0.004，0.008，0.020，0.060及0.100μmol/L的MTX濃度處理HCT116細胞24h，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)SHMT2蛋白表達量未發(fā)生任何改變，且SIRT5蛋白在低濃度的MTX(<0.060μmol/L)處理下表達量隨著濃度增加而不斷增加.當(dāng)MTX濃度高于0.1μmol/L時，細胞狀態(tài)很差，幾乎不能存活，而在0.100μmol/L濃度MTX處理下，SIRT5蛋白水平(SIRT5/Tubulin: 3.06)只有0.060μmol/L濃度MTX處理下(SIRT5/Tubulin: 6.61)的一半，因此我們認為，SIRT5表達水平在MTX濃度高于0.060μmol/L時顯著下降(圖4(a)).這也就說明了MTX藥物本身不會影響腫瘤細胞內(nèi)源SHMT2表達量，那么很有可能是通過調(diào)控SIRT5的表達水平，進而影響SHMT2的琥珀酰化修飾和酶活.進一步的實驗結(jié)果表明，SHMT2蛋白的琥珀?；揎椝皆诘蜐舛萂TX(<0.060μmol/L)處理下呈下降趨勢，在高濃度MTX(<0.060μmol/L)處理下呈上升趨勢，這也和上述SIRT5表達量的變化相符(圖4(b)).

值得注意的是，SHMT2的琥珀?；瘯档偷鞍妆旧砻富?，從而抑制相關(guān)腫瘤細胞的生長增殖.而實驗結(jié)果表明： MTX濃度大于0.060μmol/L時，才會降低癌細胞內(nèi)SIRT5蛋白量，提升SHMT2的琥珀酰化程度.而在MTX濃度小于0.060μmol/L時，MTX反而會隨著濃度提升而降低SHMT2的琥珀酰化程度，我們認為，很有可能是低濃度的MTX通過上調(diào)SIRT5-SHMT2的調(diào)控從而促進了腫瘤細胞的增殖，這也為臨床上單獨用低濃度MTX在結(jié)直腸腫瘤病人的治療中產(chǎn)生耐藥性提供了解釋.而當(dāng)濃度提升到一定程度(>0.06μmol/L)之后，才會通過抑制SIRT5表達量提高SHMT2琥珀酰化修飾，抑制腫瘤的增殖，但這樣高濃度的MTX化療對病人也會產(chǎn)生較大的傷害.

3 討 論

作為組蛋白去乙?；窼irtuins家族里的成員之一，SIRT5具有多種去?；富钚?，包括了去琥珀?；ノ於；叭ケ；?這3種蛋白翻譯后修飾的底物均被證實主要存在于細胞線粒體中，暗示SIRT5可通過調(diào)控線粒體相關(guān)蛋白的翻譯后修飾影響其功能.近來有研究表明，SIRT5能通過修飾某些代謝通路上的關(guān)鍵蛋白來調(diào)控細胞的代謝生長，包括糖酵解，脂肪酸氧化及尿素循環(huán)等[16].

雖然絲氨酸和甘氨酸屬于非必需氨基酸，但它們在腫瘤相關(guān)細胞中卻行使著必不可少的功能.絲氨酸代謝會為生產(chǎn)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, NADPH)和嘌呤提供所需的一碳代謝單位，促進腫瘤快速增長，加快腫瘤細胞內(nèi)DNA與RNA的合成代謝，從而減少細胞活性氧水平[17-18].每當(dāng)癌細胞遷移至新的病灶區(qū)時，都會面臨低葡萄糖與低絲氨酸環(huán)境，癌細胞因此會重編程其代謝途徑，從而克服環(huán)境障礙，最終成功轉(zhuǎn)移病灶.

據(jù)報道，SIRT5通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白的翻譯后修飾在絲氨酸代謝中起作用[19-20]，而SHMT2蛋白作為一碳單位代謝和氨基酸代謝溝通的橋梁，能和SIRT5發(fā)生內(nèi)源相互作用，并且其琥珀?；揎椝揭彩艿絊IRT5調(diào)控[21].SHMT2不僅能催化絲氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸，同時也會生成重要中間體5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-CH2-THF)[22-24].近年來，多項研究表明SHMT2蛋白的過表達會抑制PKM2酶活，降低細胞的耗氧量水平[25-27].但是截至目前，SHMT2蛋白翻譯后修飾的調(diào)控機制尚不明確.值得注意的是，有實驗證明SHMT2能被SIRT3去乙?；揎棧襍HMT2確實能和SIRT3相互結(jié)合[14].SIRT3和SIRT5通常被認為是線粒體內(nèi)蛋白翻譯后修飾的關(guān)鍵調(diào)控酶，且賴氨酸乙?；扮牾；稽c在絕大多數(shù)蛋白上都有所重疊，例如檸檬酸合酶(Citrate Synthase, CS)及重組人17β-羥基類固醇脫氫酶(Recombinant Human Hydroxysteroid (17-beta) Dehydrogenase 10, HSD17B10)[28].在本文中，我們驗證了SIRT5和SHMT2能夠相互作用，利用酶活實驗確定了SHMT2第181位的賴氨酸是其主要琥珀酰化位點.

一般情況下，細胞中多數(shù)SHMT2蛋白會在未激活狀態(tài)下形成二聚體.通過類比于PKM2，為了激活SHMT2，我們猜想其會在K181位點結(jié)合PLP后經(jīng)過轉(zhuǎn)化形成四聚體，這也有待后續(xù)實驗的證實.蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，SHMT1也能被琥珀?；?，且SHMT1和SHMT2存在同樣的保守的氨基酸序列.因此，SHMT1的一些功能SHMT2也可能會擁有，這為后續(xù)針對SHMT2更深入的實驗探究提供了一定的方向.

同時突變蛋白SHMT K181E相比于野生型SHMT2酶活降低，表明K181位點很可能是一個潛在腫瘤治療位點.有文獻證明，SHMT2在細胞增殖和T細胞激活上存在某種關(guān)聯(lián)[29].而將第181位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼岬奶禺愋詥伟被嵬蛔兗夹g(shù)可用于抑制與SHMT2相關(guān)的腫瘤，這為腫瘤病患提供了潛在的治療手段.

我們的研究結(jié)果表明，SHMT2的去琥珀?；潭仍礁?，自身酶活也就越高.這從另一角度說明SIRT5可能是促進腫瘤細胞生長的潛在致癌基因.但是關(guān)于SIRT5在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到的調(diào)控作用及機制還有待深入研究.近期研究表明，異檸檬酸脫氫酶1(Isocitrate Dehydrogenase 1, IDH1)突變體誘導(dǎo)的異常高琥珀?；揎棔茐木€粒體功能，外源SIRT5的引入則會抑制高琥珀酰化腫瘤細胞的增殖[30].綜上所述，SIRT5在調(diào)控不同代謝通路酶的過程中，會表現(xiàn)出不同的去?；δ?因此，SIRT5在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到的作用和其所在細胞環(huán)境息息相關(guān)，在某些特定的情況下，被調(diào)控的通路決定了對腫瘤生長的促進或抑制.

有研究報道，降低細胞內(nèi)絲氨酸和甘氨酸濃度會影響野生型HCT116細胞的增殖[31].我們猜想，由于SHMT2 K181E突變體酶活顯著降低，對絲氨酸的代謝可能會減弱，從而使細胞處于絲氨酸/甘氨酸饑餓狀態(tài).因此，SHMT2 K181E可能會致使絲氨酸/甘氨酸饑餓，從而降低腫瘤的生長繁殖速度，這一猜想仍需進一步的實驗驗證.與此同時，本實驗中還利用了臨床上廣泛運用的化療藥物，葉酸抑制劑MTX處理結(jié)直腸癌HCT116細胞，發(fā)現(xiàn)在高濃度MTX處理環(huán)境下，細胞內(nèi)SIRT5蛋白表達量明顯降低，SHMT2的琥珀?；@著升高，從而降低了SHMT2的酶活，最終抑制了腫瘤的繁殖.我們從另一個角度解釋了MTX能夠阻斷腫瘤生長的原因，但高濃度MTX化療對病人也有較大傷害.然而有趣的是，在低濃度的MTX處理下，SIRT5的表達量呈現(xiàn)一個小幅度上升趨勢，猜想可能是低濃度MTX會通過激活SIRT5-SHMT2而產(chǎn)生藥物耐受，這也為臨床上單獨用低濃度MTX在結(jié)直腸腫瘤病人的治療中產(chǎn)生耐藥性提供了解釋，提示我們臨床上可以通過低濃度MTX和干預(yù)SIRT5-SHMT2來共同治療結(jié)直腸腫瘤疾病.

綜上，我們的研究闡明了SIRT5去琥珀酰化SHMT2，增強其酶活的分子機制，拓展了對于SIRT5和SHMT2在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展中的認識，并為相關(guān)腫瘤治療提供了新的思考.