王興翠，張曉艷，裴華麗，彭佃亮

(1.濰坊科技學院 山東省高校設施園藝實驗室，山東 壽光 262700；2.山東省壽光市農業(yè)局，山東 壽光 262700)

optimization

冰菜(MesembryanthemumcrystallinumL.)，也稱冰葉日中花、非洲冰草，番杏科日中花屬，雙子葉一年矮生肉質草本植物.原產南非，耐干燥、耐鹽性較強，因其莖葉外表為植物分泌的一種偏堿性的晶狀物，看似像有一層冰，故名為冰菜[1].莖葉內含有大量的肌醇類、β胡蘿卜素、維生素K、脯氨酸及各類礦物質等機能性成分，是一種具有健康美容效果的機能性蔬菜.因其營養(yǎng)價值較高，口味獨特，已越來越受關注[2].近年來，國內關于冰草的研究報道主要集中在引種栽培方面[3-5]，在植物的耐鹽性研究上也有報道并被作為生物樣本收集[5].栽培生產上采用種子種植存在諸多限制問題：國產冰菜種子為進口雜交一代種子繁育的二代甚至三代種子，雖價格較低，但植株抗性弱、商品性差；進口種子可解決以上問題，但價格較高；冰菜種子極為細小，拱土能力較弱，經常出現無法出土腐爛、發(fā)芽率低的現象.組培苗繁殖系數大，既保證了其優(yōu)良性狀又可加快繁殖速度，但前人利用冰菜子葉節(jié)、葉片及種子萌發(fā)獲得的頂芽等為外植體誘導不定芽研究發(fā)現其再生頻率較低[6-7].為此，筆者以田間生長旺盛的冰菜幼嫩莖段及頂芽為試材建立其快繁體系，旨在篩選出非洲冰菜最佳的高頻快繁配方，為冰菜的大規(guī)模生產提供理論依據和技術支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料由濰坊壽光魯壽綠園有機蔬菜公司提供，選取田間生長的健壯的冰菜幼嫩莖段及頂芽作為初始接種材料.

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 外植體殺菌消毒

將田間生長健壯的冰菜切割成2 cm 左右莖段(帶1個腋芽)及頂芽，分別用70%的乙醇(30，40，50 s)和0.1%的升汞(3，4，5 min)進行不同時間組合的消毒處理，然后，將其接種到無激素的MS基本培養(yǎng)基中，每種處理接種60個外植體，分3次重復，15 d后統(tǒng)計并分析.

1.2.2 冰菜初代培養(yǎng)及玻璃化試管苗的控制

根據1.2.1試驗結果，冰菜外植體經最佳消毒處理后，接種到添加瓊脂(6，8，10 g·L-1)或氯化鈉(3，5，7 g·L-1)的MS培養(yǎng)基中，每種處理90個外植體，分3次重復.

1.2.3 冰菜不定芽繼代增殖快繁培養(yǎng)

選取長勢良好、健壯的冰菜試管苗，切成1.5 cm左右并去除下端葉片，接種到添加不同濃度激素配比的MS不定芽分化培養(yǎng)基上，試驗采用二因素隨機區(qū)組設計，試驗A因素為NAA濃度，分別為0.05(A1)，0.1(A2)，0.2(A3)mg·L-13個水平，B因素為6-BA濃度分別為0.5(B1)，1.0(B2)，2.0(B3)，3.0(B4)mg·L-14個水平，共計12種處理.每種處理90個外植體，分3次重復.定期觀察記錄冰菜的不定芽分化狀況，并統(tǒng)計分析.

1.2.4 冰菜不定芽生根誘導

將分化的不定芽切取單株，以MS和1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別接種到添加不同濃度激素NAA(0.1，0.3，0.5 mg·L-1)，IBA(0.1，0.3，0.5 mg·L-1)的生根培養(yǎng)基上，每種處理接種90個外植體，分3次重復.觀察并統(tǒng)計各處理的生根情況.

1.2.5 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

以上試驗，除試驗1.2.2外，培養(yǎng)基均添加8 g·L-1瓊脂、30 g·L-1蔗糖、5 g·L-1NaCl，1 mol·L-1的NaOH調節(jié)pH為5.8，121 ℃，高壓滅菌21 min.在(25±2) ℃、光照條件為(2 000 lx)16 h·d-1的條件下進行培養(yǎng).

1.2.6 數據統(tǒng)計與分析

污染率(%)=污染的外植體數/接種的外植體總數×100；

成活率(%)=成活的不定芽數/接種的外植體總數×100；

玻璃化苗發(fā)生頻率(%)=玻璃化苗發(fā)生數/叢生芽總數×100；

不定芽分化率(%)=分化不定芽外植體數/接種外植體總數×100；

不定芽分化指數=不定芽分化總數/已分化外植體個數；

生根率(%)=已生根不定芽個數/不定芽接種總數×100.

試驗所得數據采用Excel 2007進行初步整理，采用DPS15.10進行方差分析，其中多重比較及交互效應采用Duncan新復極差法.

2 結果與分析

2.1 消毒時間對冰菜無菌苗獲得的影響

經觀察發(fā)現，冰菜接種3 d后開始生長，但生長15 d后開始出現玻璃化.升汞和70%乙醇對冰菜外植體的滅菌效果列于表1.

表1 升汞和70%乙醇對冰菜外植體滅菌效果的影響

注：表中同列數值后不同大寫字母表示處理間差異極顯著(α=0.01)，不同小寫字母表示處理間差異顯著(α=0.05).

由表1可知，殺菌時間不同導致冰菜幼嫩莖段殺菌效果及對其生長的影響不同.最適的消毒時間為0.1%升汞消毒5 min，70%乙醇消毒40 s，成活率達98.3%(接種15 d統(tǒng)計).

2.2 不同濃度瓊脂及NaCl對冰菜試管苗玻璃化的影響

不同濃度瓊脂及NaCl對冰菜試管苗玻璃化的影響狀況列于表2.

表2 不同濃度瓊脂及NaCl對冰菜試管苗玻璃化的影響

注：表中同列數值后不同大寫字母表示處理間差異極顯著(α=0.01)，不同小寫字母表示處理間差異顯著(α=0.05).

由表2可以看出，隨著培養(yǎng)基添加瓊脂濃度的增加，冰菜試管苗玻璃化程度呈下降趨勢，添加8 g·L-1和10 g·L-1的瓊脂較添加6 g·L-1瓊脂的冰菜試管苗玻璃化率分別降低7.8%和10.5%，但后者植株長勢弱，植株下部葉片黃化現象嚴重.單獨添加NaCl時，冰菜試管苗玻璃化的發(fā)生率同單獨添加瓊脂有相似的變化趨勢，當NaCl為7 g·L-1時，雖然冰菜植株玻璃化率最低為10.0%，但與NaCl為5 g·L-1時沒有顯著差異，且長勢弱，葉片黃化嚴重；結合植株生長狀況綜合考慮，NaCl為5 g·L-1時效果最好.后期補充試驗表明，同時添加8 g·L-1瓊脂和5 g·L-1的 NaCl，冰菜試管苗玻璃化的發(fā)生率會顯著降低，僅為3.3%，且植株長勢良好，葉片展開，葉色濃綠，植株表面冰晶明顯，故在該試驗條件下該培養(yǎng)基最有利于防止冰菜試管苗玻璃化.

2.3 不同濃度激素對冰菜不定芽誘導分化的影響

探討不同濃度的激素NAA(A因素)和6-BA(B因素)對冰菜不定芽誘導分化的影響，結果列于表3，4.

表3 冰菜不定芽分化率及分化指數差異的方差分析

表4 不同處理間冰菜不定芽分化率和分化指數差異的多重比較

注：表中同列數值后不同大寫字母表示處理間差異極顯著(α=0.01)，不同小寫字母表示處理間差異顯著(α=0.05).

通過試驗觀察，添加較低濃度的6-BA 和NAA，冰菜試管苗葉色呈淡綠色，葉片較寬；而添加高濃度的6-BA 和NAA，冰菜試管苗葉片變窄.由表3可知，NAA濃度(因素A)和6-BA濃度(因素B)顯著影響冰菜不定芽分化，且A、B兩因素互作對不定芽分化率和分化指數有極顯著影響.由表3～4可以看出，繼代誘導增殖培養(yǎng)中6-BA較NAA對冰菜不定芽增殖作用較大，相同6-BA濃度水平下，隨著NAA濃度的增加，冰菜不定芽分化率和分化指數基本呈現逐漸降低的趨勢.當6-BA濃度為2.0 mg·L-1、NAA濃度為0.1 mg·L-1時，冰菜不定芽分化率為97.8%，分化指數較高為9.6.

2.4 不同培養(yǎng)基及不同濃度激素對誘導冰菜生根的影響

不同培養(yǎng)基及不同濃度的激素對冰菜生根的誘導結果列于表5.

表5 不同培養(yǎng)基及不同濃度的激素對冰菜試管苗生根的誘導作用

注：表中同列數值后不同大寫字母表示處理間差異極顯著(α=0.01)，不同小寫字母表示處理間差異顯著(α=0.05).

由表5可知，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，隨著添加NAA或IBA濃度的增加，冰菜試管苗的生根率、株平均根數均呈現先升高后降低的趨勢.添加相同濃度的NAA或IBA，冰菜在1/2MS培養(yǎng)基上試管苗的誘導生根狀況與MS培養(yǎng)基上有相似的變化規(guī)律，但前者誘導生根效果好，表現為當IBA為0.3 mg·L-1時，生根率最高可達95.6%，株平均根數多達13.6條，根長較長.

3 討 論

3.1 不同濃度瓊脂及NaCl對試管苗玻璃化的影響

外植體的生長狀況、培養(yǎng)環(huán)境條件、培養(yǎng)基成分等均可影響試管苗玻璃化的發(fā)生[8].凝膠力強度的變化受培養(yǎng)基中瓊脂濃度的影響，其大小影響培養(yǎng)基水勢及水分供應狀況[9]，提高培養(yǎng)基的瓊脂濃度，有利于控制玻璃化苗的發(fā)生[10].筆者的試驗證實，適當增加培養(yǎng)基中瓊脂濃度能夠降低冰菜試管苗玻璃化的發(fā)生，與陳思等對冰菜的研究結果不盡相同，但兩試驗均發(fā)現添加一定濃度的NaCl能有效控制冰菜試管苗玻璃化的發(fā)生[11].

冰菜作為一種聚鹽性真鹽生植物，一定量的鹽分是促進植株生長發(fā)育的關鍵因素[12].研究發(fā)現，CAD和乙烯在脅迫條件下是細胞伸長必不可少的因素，冰菜在500 mmol NaCl環(huán)境下其真葉的CAD的積累與乙烯的增加呈正相關關系[13]，培養(yǎng)基中適度添加NaCl有利于冰菜的生長[14].Van den Dries等[15]認為，擬南芥玻璃化苗的發(fā)生是由于質外體超度含水干擾呼吸作用的電子傳遞引發(fā)氧化脅迫導致；在藍莓[16]和石竹[17]玻璃化試管苗的研究中也發(fā)現玻璃化嚴重程度與抗氧化酶系統(tǒng)失衡及活性氧代謝異常呈正相關關系.研究發(fā)現，冰菜在低濃度鹽溶液中能夠迅速提高其體內的滲透調節(jié)物質的含量及抗氧化酶的活性[18]，冰菜細胞懸浮培養(yǎng)時，一定的鹽脅迫可使PEPCase潛在活性和蘋果酸含量增加[19].綜合以上觀點發(fā)現，真鹽生植物的正常生長離不開一定量的Na+存在，低濃度的NaCl使植物體內積累的滲透調節(jié)物質增多、抗氧化體系的活性增強，能夠有效防止氧化脅迫發(fā)生，從而在組織培養(yǎng)時減少玻璃化苗的產生.也有研究認為，冰菜作為一種C3/CAM可轉換型植物，試管苗是否玻璃化與冰菜進行C3植物光合作用或通過CAM途徑進行光合作用所積累的產物不同有關.有關NaCl如何有效控制冰菜試管苗玻璃化發(fā)生的生理機制需要進一步試驗進行數據支持及論證.

3.2 不同濃度的激素配比對冰菜不定芽分化的影響

植物組織培養(yǎng)再生快繁體系建立成功的關鍵是不定芽的誘導和增殖，而增加幼芽的增殖數量和速率是再生體系中重要的一步[20].不同植物的不同外植體、生長調節(jié)物質的種類及配比控制不定芽或叢生芽的形成與增殖，6-BA對細胞分裂和誘導芽的分化具有重要促進作用[21]，冰菜帶子葉的頂芽為外植體，其最適宜增殖的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA[11].從試驗結果得出，非洲冰菜不定芽分化的最適培養(yǎng)基為添加2.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基，冰菜不定芽分化率為97.8%，分化指數高達9.6，且植株葉色正常，生長旺盛，與前人研究結果不同的原因可能是冰菜前期培養(yǎng)及外植體的選擇不同.

3.3 不同培養(yǎng)基及不同濃度的激素對誘導冰菜不定芽生根的影響

NAA、IAA和IBA能誘導并促進根的生長，是植物組織培養(yǎng)中廣泛應用的誘導不定根的外源激素，但添加的濃度過高會起反作用；生根培養(yǎng)對基本培養(yǎng)基的類型要求不嚴，但培養(yǎng)基若N，P，K鹽含量較高則會抑制根的發(fā)生，將鹽濃度適當稀釋或降低至更低水平有利于根的誘導與發(fā)生[20].筆者的試驗結果顯示，接種20 d時不添加任何激素的培養(yǎng)基上冰菜不定芽發(fā)根率較低，添加NAA和IBA的培養(yǎng)基上冰菜不定芽生根率較高，根生長較旺，1/2 MS培養(yǎng)基添加0.3 mg·L-1IBA時，生根效果最好.該結果與Michael及陳思等[7,11]研究得出的冰菜在無激素MS培養(yǎng)基中生根率達100%，在有NAA存在時生根情況不理想的結果不一致，其原因可能與統(tǒng)計時間較早及前期初代接種、誘導增殖時添加外源生長調節(jié)劑濃度配比不同導致冰菜內源激素變化引發(fā)誘導生根狀況不同有關，同時證實了添加適當濃度配比的外源生長調節(jié)劑有利于誘導冰菜不定芽提前生根.

4 結束語

冰菜組培苗生長情況見圖1所示.

(a)～(c)為MS培養(yǎng)基分別添加6，8，10 g·L-1瓊脂時冰菜生長情況；(d)～(f)為MS培養(yǎng)基分別添加3，5，7 g·L-1 NaCl時冰菜生長情況；(g)為MS培養(yǎng)基添加8 g·L-1瓊脂、5 g·L-1 NaCl時冰菜生長情況；(h)為冰菜不定芽分化增殖；(i)為冰菜誘導生根時根的生長狀況.圖1 不同培養(yǎng)基中冰菜組培苗的生長狀況

筆者利用田間生長旺盛的幼嫩冰菜莖段及頂芽，通過調整培養(yǎng)基中瓊脂、NaCl及激素濃度的配比，克服了冰菜在組培過程中玻璃化的問題，建立了穩(wěn)定的快繁體系.實驗結果顯示，用70% C2H5OH+0.1% HgCl2分別處理40 s，5 min時，莖段或莖尖的成活率最高；MS培養(yǎng)基添加2.0 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、8 g·L-1瓊脂和5 g·L-1NaCl時，冰菜試管苗玻璃化發(fā)生率最低，植株葉色正常，生長旺盛，植株表面冰晶明顯，且不定芽分化指數可達9.6；1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA培養(yǎng)基最有利于試管苗生根，且側根較多.