左 琴 王勁松 范 濤 朱婉月 劉秋菊 劉佐民

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，國家嚙齒類實驗動物種子中心，北京 100050)

隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，研發(fā)產(chǎn)生的遺傳工程小鼠日漸增加，對于這些遺傳資源的種質(zhì)保存目前主要采用精子冷凍和胚胎冷凍技術(shù)。精子冷凍和胚胎冷凍技術(shù)已經(jīng)成為資源保存的主要手段和方法，但是一些遺傳工程小鼠尤其是疾病模型小鼠因自身的繁殖能力低下，或未成年就死亡，或因先天性無輸卵管、子宮等而出現(xiàn)繁殖困難或斷種等問題[1]。卵巢冷凍和卵巢異體原位移植技術(shù)就成為保存此類雌性遺傳工程小鼠或珍惜動物生殖功能的有效手段,是種質(zhì)資源保存方法的必要補充，同時在研究不孕癥治療模型方面也有著廣闊的應用前景。

卵巢組織移植作為研究繁殖生理的重要工具，多數(shù)的卵巢生理研究是將卵巢組織移植到皮下、腎包膜下等不同部位研究和分析激素的產(chǎn)生和卵巢功能的重建，本研究采用將卵巢移植到同種不同受體的同一部位即原位移植方式，使得移植受體可以實現(xiàn)妊娠與生育，這對滿足特定個體生育要求以及挽救瀕危動物物種具有特殊意義，1940年Robertson[2]首次報道了小鼠卵巢原位移植，此后這項技術(shù)得到Jackson實驗室的改進和應用。小鼠卵巢組織冷凍移植并得到后代首次由Parrot[3]在1960年報道，研究者們隨后進行了卵巢慢速冷凍、玻璃化冷凍和快速冷凍的研究。

本實驗選用DAP213快速冷凍法[4]凍存卵巢并在復蘇后原位移植，采用兩種背景品系小鼠進行異體原位移植并進行比較，通過比對可以更快確定遺傳背景，更好地完善冷凍保種體系；通過比對幼鼠毛色，可以直觀地辨別其目的基因，確認遺傳背景，顯著加快了基因型的檢測工作，為小鼠種質(zhì)資源保存奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

M2培養(yǎng)液(M7167-100ML, SIGMA)，M2培養(yǎng)液(M7292-100ML, SIGMA)，0.7%戊巴比妥鈉溶液(P3761-5G, SIGMA)，0.9%生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；0.25 mol/L蔗糖溶液、1 mol/L DMSO培養(yǎng)液和DAP213冷凍保護液(COSMO BIO CO.,LTD, JAPAN)。

CO2培養(yǎng)箱(8000DH, THERMO)；體式顯微鏡(SMZ645, NIKON)；冰箱(西門子KK21V1160 W)；維納斯剪和脂肪鑷等手術(shù)器械。

1.2 實驗動物

本研究中使用C57BL/6 J、B6 albino(JAX000058)等品系均為SPF級小鼠，由國家嚙齒類實驗動物種子中心提供并飼養(yǎng)。10日齡體質(zhì)量6～8 g的C57BL/6 J和遺傳背景來源于C57BL/6 J的SCARB2、PSGL1、IGB3S遺傳工程純合雌鼠(本單位研發(fā))為提供卵巢的供體鼠，4周齡13～15 g的C57BL/6 J和B6 albino雌鼠為受體鼠接受卵巢移植，B6 albino除了毛色基因與C57BL/6 J不一樣外其他遺傳背景相同，10周齡體質(zhì)量26～28 g的C57BL/6 J成年雄鼠用于與卵巢移植復蘇后受體鼠交配，在每個實驗分組中均分別使用5只供體鼠及受體鼠。實驗中共使用50只供體鼠和50只受體鼠，實驗動物生產(chǎn)許可證號是SCXK(京)2014-0013；實驗動物使用許可證號是SYXK(京)2016-0004。

本實驗在中國食品藥品檢定研究院實驗動物倫理委員會監(jiān)督下進行，福利倫理審查證號是中檢動(福)第2014(B)003號，所有實驗在中國食品藥品檢定研究院國家嚙齒類實驗動物種子中心進行。

1.3 供體鼠卵巢的取材

10日齡供體幼鼠頸椎脫臼處死，皮膚消毒，打開腹腔，暴露兩側(cè)子宮及卵巢，用脂肪夾固定卵巢脂肪，在解剖鏡下用兩把鑷子撕開卵巢囊膜，暴露卵巢后用維納斯剪剪斷卵巢蒂底部連接處，將整個卵巢取出，放置到0 ℃冰盒上平衡的M2溶液中準備凍存或直接移植。

1.4 卵巢冷凍保存

采用DAP213方法凍存[4]，用微量加樣器取100 μL的1 mol/L的DMSO溶液在60 mm培養(yǎng)皿上做4個液滴，將已經(jīng)準備好的供體卵巢從M2溶液轉(zhuǎn)移到DMSO液滴中平衡1 min，連續(xù)在DMSO溶液中轉(zhuǎn)移平衡3次，最后一次平衡后將卵巢放入已在冰盒上內(nèi)已有5 μL 1 mol/L的DMSO凍存管中，再次檢查兩側(cè)卵巢是否均放入，完成后將凍存管放入冰盒平衡5 min，再將45 μL的DAP213凍存保護劑加入凍存管，擰上凍存管蓋子，再次平衡5 min，然后快速將凍存管放入到液氮罐中的凍存架上。

1.5 凍存卵巢的復蘇

采用文獻方法復蘇[4]，從液氮罐中取出冷凍保存3～6個月的凍存管，迅速擰開蓋子，倒出管內(nèi)液氮，立即計時30 s，用移液器取已經(jīng)在37 ℃預熱的0.25 mol/L蔗糖溶液900 μL，在計時器計時，到時將蔗糖溶液順著距凍存管底部1 cm的管壁打入，并吸吹20次左右后將全部溶液連同卵巢吸出放到培養(yǎng)皿中，找到卵巢后，立即移入已經(jīng)在37 ℃預熱的100 μL的M16溶液液滴中，在液滴中平衡1 min，同樣轉(zhuǎn)移平衡10次后，將已經(jīng)復蘇回收的卵巢放入在冰盒上平衡的100 μL M2液滴中，準備移植待用。

1.6 受體卵巢移植

受體鼠用0.7%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹背部開口，摘除整個卵巢，再將新鮮或解凍復蘇的四個品系遺傳工程小鼠卵巢移植到C57BL/6 J和B6 albino受體鼠移出卵巢的原位中，將卵巢包膜覆蓋住移植卵巢，隨后將子宮和卵巢輕輕放回腹腔，縫合肌肉層和皮膚層。另外一側(cè)卵巢用同樣方法進行操作。手術(shù)后將受體鼠置于37 ℃恒溫臺保溫，蘇醒后送回飼養(yǎng)間。

1.7 移植后繁殖方式

將卵巢移植后受體鼠飼養(yǎng)到10周齡，與10周齡性成熟C57BL/6 J雄鼠1∶1長期交配，妊娠產(chǎn)仔后，觀察和記錄每胎產(chǎn)仔數(shù)及毛色。遺傳工程小鼠剪尾進行基因檢測。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6 J新鮮和凍存卵巢原位移植到不同受體的比較

將10日齡C57BL/6 J雌鼠新鮮卵巢和凍存復蘇卵巢原位移植到4周齡C57BL/6 J和B6 albino體內(nèi)，表1結(jié)果顯示，C57BL/6 J新鮮卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(3.8±1.5)個；C57BL/6 J凍存卵巢移植妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.8±0.8)個,新鮮卵巢移植和凍存卵巢移植比較有顯著性差異(P<0.05)。C57BL/6 J新鮮卵巢移植到B6 albino妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(4.0±1.0)個，毛色均為黑色；凍存卵巢移植妊娠率是100%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.6±1.0)個，毛色均為黑色，受體是B6 albino，易從毛色就可以分辨出生小鼠來自于供體小鼠，新鮮卵巢移植和凍存卵巢移植比較有極顯著性差異(P<0.01)。兩種受體在凍存卵巢移植后的產(chǎn)仔數(shù)均低于新鮮卵巢產(chǎn)仔數(shù)。

表1 新鮮和凍存卵巢異體原位移植比較Table 1 Comparing the result of fresh and frozen/thawed ovarian heterotopically transplantion

2.2 遺傳工程小鼠凍存卵巢原位移植到不同受體的比較

將10日齡純合遺傳工程小鼠SCARB2、PSGL1、IGB3S雌鼠凍存復蘇卵巢原位移植到4周齡C57BL/6 J和B6 albino體內(nèi)，表2結(jié)果顯示，SCARB2品系凍存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是100%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.8±1.5)個；移植到B6 albino妊娠率是60%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(3.3±1.2)個，毛色均為黑色,兩種受體比較有顯著性差異(P<0.05)。PSGL1品系凍存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(3.3±1.1)個；移植到B6 albino妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.8±1.1)個，毛色為黑色, 兩種受體比較無顯著性差異。IGB3S品系凍存卵巢移植到C57BL/6 J妊娠率是60%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.7±0.5)個；移植到B6 albino妊娠率是80%，平均產(chǎn)仔數(shù)是(2.3±0.8)個，毛色為黑色，兩種受體比較有顯著性差異(P<0.05)。基因檢測后均為雜合子。

表2 遺傳工程小鼠凍存卵巢異體原位移植比較Table 2 Comparing the result of frozen/thawed genetically modified ovarian heterotopically transplantion

3 討論

彭南妮等[5]總結(jié)了卵巢移植技術(shù)的進展，19世紀60年代開始進行卵巢移植技術(shù)的研究，并相繼成功進行了小鼠、大鼠、兔、羊、獼猴和人的卵巢移植，開創(chuàng)了卵巢自體原位移植，自體異位移植，同種異體移植和異種移植等技術(shù)。本實驗進行了小鼠的同種異體原位卵巢移植。Lara等[6]將受體動物雙側(cè)卵巢全切，體內(nèi)缺乏性激素的條件下，發(fā)現(xiàn)植入異體的雙側(cè)卵巢發(fā)育良好，具有內(nèi)分泌功能，并能與上級器官，即下丘腦垂體產(chǎn)生反饋應答，維持正常的動情周期，洪勝輝[7]將10月齡背景為C57BL/6 J小鼠的轉(zhuǎn)基因小鼠新鮮卵巢取出，移植到8周齡C57BL/6 J體內(nèi)，得到轉(zhuǎn)基因小鼠的雜合后代，郁麗麗等[1]以10日齡、20日齡和4周齡鼠的卵巢為供體，移植到4周齡同品系的小鼠體內(nèi)的結(jié)果顯示，將卵巢異體移植受體后和正常的雄鼠交配，三組實驗鼠均可懷孕產(chǎn)仔說明移植卵巢可以在受體內(nèi)存活，并正常發(fā)育成熟和輸卵管子宮建立互動關(guān)系。本實驗將10日齡 C57BL/6 J小鼠新鮮和凍存卵巢移植到4周齡C57BL/6 J及B6 albino，恢復后和正常雄鼠交配，均妊娠產(chǎn)仔，與以上結(jié)論相符。

Parrot[3]將卵巢組織切片在12%甘油中平衡40 min再慢速冷凍到-79 ℃，原位移植后1/10的小鼠妊娠產(chǎn)仔。1997年，Gunasena等[8-9]發(fā)表了關(guān)于小鼠卵巢冷凍保存的兩篇文章，報道了整個卵巢凍存后原位移植產(chǎn)仔，第一篇文章中是將凍存復蘇后的卵巢移植給提供卵巢的同一只雌鼠，結(jié)果有63%的妊娠率，這個研究中存在一個問題，即是不能區(qū)分妊娠是由凍存復蘇移植卵巢導致的或是之前的卵巢殘余組織導致的妊娠，在第二篇文章中使用免疫缺陷小鼠作為受體，結(jié)果有25%的妊娠率。兩次研究中的凍存方法都一樣，用1.4 mol/L DMSO作為凍存液，在液氮蒸汽平衡后用程序降溫儀慢速冷凍的方法。1998年Jorge等[10]采用慢速冷凍法凍存小鼠半個卵巢，在復蘇移植后有57%的妊娠率。2004年朱孝榮等[11]用玻璃化冷凍液EFS40對Latsl基因敲除雜合子小鼠卵巢進行玻璃化冷凍，復蘇后卵巢囊原位移植，移植后妊娠率為33.3%，平均產(chǎn)仔數(shù)為(3.7±2.2)只。本研究用在胚胎冷凍上已經(jīng)取得極高成活率的DAP213冷凍保存液[4]，快速冷凍保存10日齡的C57BL/6 J小鼠及遺傳工程小鼠卵巢，復蘇及原位移植到C57BL/6 J和B6 albino品系后有60%以上的妊娠率，平均產(chǎn)仔數(shù)在(2.3±0.8)只以上，并且通過移植到除了毛色基因不一樣，有相同遺傳背景的B6 albino小鼠上，在妊娠產(chǎn)仔后很容易通過幼鼠的毛色辨別是否來自于C57BL/6 J的背景。卵巢移植面臨的最大障礙是不同個體之間存在免疫排斥反應，要選擇遺傳背景相同的受體，但有時沒有合適的相同背景的受體，進行卵巢的異種移植主要選用免疫缺陷動物作為移植受體如裸鼠、重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠等[5]，所以下一步的研究將進行凍存卵巢的異種移植。