楊紹華 劉華清 王鋒

摘?要：光/溫敏核雄性不育基因在水稻雜種優(yōu)勢利用中發(fā)揮著重要作用。發(fā)掘光/溫敏核雄性不育突變體及其基因有助于更好地了解水稻中光/溫敏核雄性不育的機制并豐富遺傳資源。本研究在秈稻材料明恢86的轉(zhuǎn)基因后代中鑒定了1個雄性不育突變體，該突變體在正常生長季表現(xiàn)為雄性不育，花藥較野生型小，淡白色，鏡檢無花粉，孕穗期低溫處理后育性恢復(fù)，為1個溫敏雄性不育突變體，命名為

mh86s。利用突變體mh86s分別和其野生親本明恢86及秈稻材料93-11雜交，構(gòu)建F2遺傳群體，遺傳分析表明雄性不育性狀由1對隱性核基因控制。采用圖位克隆技術(shù)將該溫敏雄性不育基因定位在第2染色體分子標(biāo)記Indel7.38和SNP3之間49.8 kb的物理區(qū)間內(nèi)。在該定位區(qū)間內(nèi)包含已克隆的溫敏雄性不育基因tms5。測序結(jié)果表明，突變體mh86s中tms5基因和野生型相比，第2外顯子1個堿基發(fā)生了替換（G-T），導(dǎo)致推測的161位氨基酸由甘氨酸變?yōu)槔i氨酸。利用突變體mh86s和攜帶tms5基因的溫敏不育系HD9802S雜交，F(xiàn)1表現(xiàn)為溫敏雄性不育。據(jù)此推斷突變體mh86s中的溫敏雄性不育基因為tms5的新等位基因，命名為tms5?mh86。研究結(jié)果豐富了tms5基因資源，有助于解析tms5基因結(jié)構(gòu)與功能，相應(yīng)的分子標(biāo)記亦可用于tms5?mh86的標(biāo)記輔助選擇。

關(guān)鍵詞：溫敏雄性核不育;基因定位;水稻

中圖分類號：S511?文獻標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）01-0001-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.01.001

Identification and Gene Cloning of the Thermo?sensitive Male Sterile Mutant mh86s in Rice

YANG Shao?hua， LIU Hua?qing， WANG Feng

（Fujian Provincial Key Laboratory of Genetic Engineering for Agriculture， Biotechnology Institute of

Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： Photo?or thermo?senstive genic male sterile gene （PGMS or TGMS） has played an important role in the utilization of heterosis in rice. The identification of PGMS or TGMS mutants and genes could help to better understand the mechanism of PGMS or TGMS in rice and enrich the genetic resources. In this study， a male sterile mutant was identified from the transgenic offspring of Minghui 86， an indica rice material. The mutant showed male sterility in the normal growth season， the anthers were smaller than those of the wild type， pale white， and no pollen was detected by microscopy. The fertility could be recovered after the low?temperature treatment at booting stage， and the mutant was a thermo?sensitive male sterile mutant， which was named mh86s. The mutant mh86s was hybridized with their wild parent Minghui 86 and the indica rice material 93-11， respectively， thus to construct the F2 genetical population. And the genetic analysis showed that the male?sterile character was controlled by a pair of recessive genic gene. By using the map?based cloning， the gene of thermo?sensitive male sterility was located in the 49.8 kb physical interval between the molecular markers Indel7.38 and SNP3 of the chromosome 2， and the cloned thermo?sensitive male sterility gene tms5 was included in the mapping interval. The sequencing analysis revealed that there was a single?base substitution （G to T） in the second exon of tms5 gene in the mutant mh86s compared to the wild type， which led the presumed amino acid was changed from glycine to valine at the 161th position. F1 was characterized by thermo?sensitive male sterility by the hybridization of the mutant mh86s and the thermo?sensitive male sterile line HD9802S carrying

tms5 gene. Therefore， it was inferred that the gene of thermo?sensitive male sterility in the mutant mh86s was the new allele of

tms5， which was named tms5?mh86. The results of this study enriched the tms5 gene resources and contributed to the analysis of tms5 gene structure and function， and the corresponding molecular markers could also be used in the marker?assisted selection of tms5?mh86.

Key words： Thermo?senstive genic male sterility; Gene mapping; Rice

水稻是一種以自交為主的常異交作物，雄性不育在水稻雜種優(yōu)勢利用中發(fā)揮著重要作用，是一種重要的遺傳資源。因此發(fā)掘水稻雄性不育突變體，充分闡明雄配子發(fā)育機制有著重要的理論意義及應(yīng)用價值。到目前為止，發(fā)現(xiàn)并鑒定了大量的水稻雄性不育突變體及其控制基因[1]，其中有些突變體為環(huán)境敏感型，在不同條件下表現(xiàn)為雄性不育或可育。典型的有受光周期或溫度調(diào)控的光敏/溫敏雄性核不育基因

tms5[2]、pms1[3]、pms3[4]、tms10[5]和csa[6]，以及近年來報道的濕度敏感型雄性核不育基因OsOSC12[7]和hms1[8]。

tms5基因編碼的RNA酶Zs1，降解3個泛素核糖體L40融合蛋白基因（Ub40）的mRNA，在高溫條件下，Ub40基因表達量增加，而突變體核酶功能缺失， Ub40 的mRNA不能降解而積累，導(dǎo)致花粉不育。在低溫條件下Ub40基因表達量較低，不影響花粉發(fā)育，表現(xiàn)為育性正常[2]。pms1基因編碼長鏈非編碼RNA PMS1T，是microRNA2188的靶基因，在miRNA2188的作用下產(chǎn)生21 nt的phasiRNA。Pms1在miRNA靶位點附近的1個SNP造成phasiRNA積累程度的差異，長日照條件下，phasiRNA大量積累導(dǎo)致雄性不育，而短日條件下phasiRNA積累較少，育性正常[3]。pms3是最早發(fā)現(xiàn)的光敏雄性核不育突變體農(nóng)墾58S中鑒定的，

pms3基因編碼長鏈非編碼RNA，農(nóng)墾58S中該基因有1個C突變?yōu)镚，導(dǎo)致長鏈非編碼RNA甲基化程度發(fā)生改變，長日條件降低了長鏈非編碼RNA表達量，從而使得花藥發(fā)育紊亂而雄性不育[4]。csa基因為MYB轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控水稻花藥中糖的分配，該基因突變后水稻在短日照下表現(xiàn)為雄性不育，而長日照時育性恢復(fù)[6]。水稻tms10

突變體表現(xiàn)為高溫雄性不育，低溫雄性可育的表型，育性轉(zhuǎn)換臨界點溫度為22～24℃。TMS10編碼1個亮氨酸受體激酶，高溫條件下TMS10激酶活性在水稻花藥絨氈層的降解過程中起重要作用，而在tms10突變體中絨氈層不能正常降解導(dǎo)致花藥外壁發(fā)育異常[5]。濕度敏感型雄性不育基因OsOSC12為三萜合酶（OsOSC12/OsPTS1）催化2，3?環(huán)氧鯊烯產(chǎn)生1種二環(huán)三萜化合物禾谷絨氈醇，突變基因?qū)е禄ǚ壑泻坦冉q氈醇明顯減少，使得突變變得更容易脫水而失去活性，測試表明在濕度低于60%的環(huán)境中突變體表現(xiàn)為不育，而在濕度高于80%的環(huán)境中則表現(xiàn)為完全可育，是一種新型的濕度敏感型雄性核不育材料[7]。hms1基因編碼1個β?酮脂酰輔酶A合酶，影響花粉壁中長鏈脂肪酸的合成，該基因突變后導(dǎo)致突變體花粉壁油層缺陷，使得花粉保水能力下降，在低濕條件迅速皺縮而失去活性，從而導(dǎo)致雄性不育[8]。

由于環(huán)境敏感型水稻雄性不育能通過控制環(huán)境條件在可育和雄性不育之間轉(zhuǎn)換，因此可以利用其在可育狀態(tài)下正常繁殖，在雄性不育狀態(tài)下生產(chǎn)雜交種，能規(guī)避三系雜交水稻中恢保關(guān)系的制約，在雜種優(yōu)勢利用中發(fā)揮重大的作用。發(fā)掘和鑒定更多的環(huán)境敏感型水稻雄性不育突變體及其控制基因有著重要的應(yīng)用價值及理論意義。本研究在秈稻品種明恢86的組織培養(yǎng)后代中鑒定了1個溫敏雄性核不育突變體明恢86S，對突變基因進行了精細定位，序列分析及等位分析推測突變基因是溫敏雄性核不育基因tms5的新等位基因。

1?材料與方法

1.1試驗材料

溫敏雄性不育突變體明恢86S為本實驗室在秈稻品種明恢86組培后代中發(fā)現(xiàn)并鑒定。明恢86及雜交親本秈稻品種93-11，兩系不育系HD9802S均為本實驗室保存品種。

1.2表型鑒定

抽穗期取即將開花的小穗，解剖鏡下觀察花藥形態(tài)特征。花粉育性鑒定采用1% I2?KI染液染色，顯微鏡下觀察并拍照。突變體抽穗育性鑒定為雄性不育后割兜再生，再生株減數(shù)分裂期時在22℃低溫冷水池處理7 d，然后移栽自然環(huán)境，抽穗時鑒定花粉育性。

1.3遺傳分析及基因定位

將突變體分別與其野生型明恢86及秈稻品種93-11雜交。F1自交后獲得F2。在F2群體抽穗時按單株調(diào)查花粉育性并統(tǒng)計分離比。利用突變體和93-11雜交的F2群體中的雄性不育株作為定位群體。從實驗室構(gòu)建的電子圖譜中每條染色體選擇均勻分布的6個SSR分子標(biāo)記分析22個不育單株[9]，顯著偏離孟德爾分離比的分子標(biāo)記為連鎖標(biāo)記，在連鎖標(biāo)記附近根據(jù)93-11和本實驗室明恢86重測序序列差異開發(fā)Indel和SNP標(biāo)記進行連鎖關(guān)系驗證并進行基因定位。Indel標(biāo)記利用3%瓊脂糖或8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。SNP標(biāo)記采用等位特異性擴增[10]，先利用外圍引物擴增出靶序列，然后再分別利用位點特異的內(nèi)部引物和一條相應(yīng)的外部引物擴增，通過擴增產(chǎn)物的有無判斷基因型。

1.4?候選基因分析

采用水稻基因組預(yù)測項目網(wǎng)站的基因注釋信息（rice genome annotation project，http：//rice.plantbiology.msu.edu/）進行基因預(yù)測。候選基因通過分段PCR擴增，測序比較突變體和野生型序列差異。

2?結(jié)果與分析

2.1?突變體表型特征

在營養(yǎng)生長期，突變體和野生型表型無明顯變化，在福州壽山基地夏季8月高溫抽穗揚花時突變體穗不能完全抽出（圖1A），花藥呈淡黃至白色，偏小（圖1B），碘染顯示無花粉（圖1D）。突變體減數(shù)分裂期22℃低溫冷水池處理7 d后，待再生穗抽穗時觀察發(fā)現(xiàn)花藥變黃，碘染后顯微觀察發(fā)現(xiàn)大部分花粉為圓敗或典敗類型，少量為正常黑染類型（圖1C）。表明突變體經(jīng)低溫冷水處理后花粉育性得到部分恢復(fù)，為溫度敏感型雄性不育。因此將突變體命名為明恢86S（minghui86S，mh86s）。

2.2?突變體遺傳分析及基因精細定位

利用突變體mh86s和其野生型雜交，構(gòu)建F2群體，在福州壽山基地8月抽穗時調(diào)查育性，在143株群體中可育株和不育株分別為108和35株，卡方檢驗分離比符合3∶1（χ2= 0.02<χ20.05，1=3.84），表明突變體mh86s的雄性不育受單一隱性基因控制。利用突變體mh86s和93-11雜交構(gòu)建的F2群體中的雄性不育株用于連鎖分析及基因定位，篩選到位于第2號染色體上的標(biāo)記RM5897和RM6378和目的基因基因連鎖。進一步，將上述2個標(biāo)記分析172個不育單株，分別檢測到9株和6株不同的重組體。上述結(jié)果表明突變基因位于兩分子標(biāo)記之間。為精細定位該突變基因，擴大群體到923株，先利用RM5897和RM6378篩選出重組體，再利用新開發(fā)的Indel和SNP分子標(biāo)記對重組體進行基因型鑒定，最終將目的基因定位在水稻第2號染色體分子標(biāo)記Indel7.38和SNP3之間49.8 kb的物理區(qū)間。基因定位用到的分子標(biāo)記列于表1。

2.3?候選基因分析

根據(jù)水稻基因組預(yù)測項目網(wǎng)站的基因注釋信息可知，精細定位區(qū)間內(nèi)包含8個基因（圖2B），其中1個為已克隆的溫敏雄性不育基因tms5。因此通過PCR擴增后測序比較突變體mh86s及其野生型品種明恢86的基因組序列。序列比較發(fā)現(xiàn)在第2外顯子的第2個，即基因CDS區(qū)距起始密碼ATG下游482 bp處，堿基G替換為T，導(dǎo)致編碼第161位氨基酸由甘氨酸變?yōu)槔i氨酸（圖2C）。為驗證該突變是否導(dǎo)致mh86s的溫敏雄性核不育，以突變體mh86s為母本，含tms5

基因的水稻品種HD9802S為父本雜交，F(xiàn)1在福州8月中旬抽穗時表現(xiàn)為雄性不育，割兜后再生，10月中旬抽穗育性恢復(fù)。上述結(jié)果表明本研究鑒定的突變位點導(dǎo)致了突變體mh86s

的溫敏雄性不育，為tms5的新等位基因，命名為tms5?mh86。

3?討論與結(jié)論

tms5基因是我國水稻兩系不育系中廣泛使用的光溫敏核不育基因資源[4，11-12]，突變基因編碼一個截短的RNA酶Zs1，導(dǎo)致酶功能缺失，不能正常降解導(dǎo)致雄性不育的UBL40。本研究鑒定的突變基因經(jīng)等位性測試，表明突變基因為tms5的1個新的等位突變。tms5基因為生產(chǎn)上廣泛使用的溫敏雄性不育基因，具有重要的應(yīng)用價值，為探索其作用機制或創(chuàng)制優(yōu)良的兩系不育系，眾多研究者利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制了大量的tms5基因的等位突變，但這些突變均為提前終止或移碼突變等功能缺失突變。而本研究鑒定的等位突變僅存在1個氨基酸的替換，導(dǎo)致單個氨基酸的改變，表明該位點是tms5基因不可或缺的重要的功能位點。但該位點如何影響基因功能還有待進一步研究。

溫敏雄性不育起點溫度是水稻兩系不育系的一個重要參數(shù)，較低的起點溫度有利于保證雜交種的生產(chǎn)純度，但過低的起點溫度又不利于不育系的自我繁殖。大量研究及實踐表明，起點溫度和遺傳背景密切相關(guān)，不同遺傳背景起點溫度差異很大。突變體mh86s在22℃冷水處理7 d后育性部分恢復(fù)，僅極少量結(jié)實，表明突變體mh86s轉(zhuǎn)育起點溫度較低，可以用于培育兩系不育系。研究中發(fā)現(xiàn)，定位群體中的不育株秋季低溫再生穗結(jié)實率差異較大，少部分能正常結(jié)實，表明群體中不同個體不育起點溫度差異較大，和前人結(jié)果一致。因此利用tms5?mh86等位基因有望能培育出具有不同起點溫度的兩系不育系。本研究鑒定新的tms5等位突變基因豐富了基因資源，有利于對水稻兩系不育系不育起點溫度的調(diào)控，研究中所開發(fā)的緊密連鎖的分子標(biāo)記也可利用與分子標(biāo)記輔助選擇。

參考文獻：

[1]GUO J X，LIU Y G.Molecular control of male reproductive development and pollen fertility in rice[J].J Integr Plant Biol，2012，54（12）：967-978.

[2]ZHOU H，ZHOU M，YANG Y，et al.RNase ZS1 processes UbL40 mRNAs and controls thermosensitive genic male sterility in rice[J].Nature Communications，2014，5：4884.

[3]FAN Y，YANG J，MATHIONI S M，et al.PMS1T，producing phased small?interfering RNAs，regulates photoperiod?sensitive male sterility in rice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2016，113（52）：15144-15149.

[4]DING J，LU Q，OUYANG Y，et al.A long noncoding RNA regulates photoperiod?sensitive male sterility，an essential component of hybrid rice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（7）：2654-2659.

[5]YU J，HAN J，KIM Y，et al.Two rice receptor?like kinases maintain male fertility under changing temperatures[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2017，114（46）：12327-12332.

[6]ZHANG H，XU C，HE Y，et al.Mutation in CSA creates a new photoperiod?sensitive genic male sterile line applicable for hybrid rice seed production[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 2013，110（1）：76-81.

[7]XUE X，ZHOU Y，WANG X，et al.Deficiency of a triterpene pathway results in humidity?sensitive genic male sterility in rice[J].Nature Communications，2018，9（1）：604-613.

[8]CHEN H Q，ZHANG Z G，NI E D，et al.HMS1 interacts with HMS1I to regulate very?long?chain fatty acid biosynthesis and the humidity?sensitive genic male sterility in rice（Oryza sativa）[J].New Phytol，2019：doi：10.1111/nph.16288.

[9]黃燕娟，華亞鵬，劉華清，等.三個基于水稻明恢86 的SSR電子遺傳圖譜的構(gòu)建[J].分子植物育種，2008，6（4）：655-663.

[10]NEWTON CR，GRAHAM A，HEPTINSTALL LE，et al.Analysis of any point mutation in DNA：The amplification refractory mutation system （ARMS）[J].Nucleic Acids Res，1989，17：2503-2516.

[11]范優(yōu)榮，曹曉風(fēng)，張啟發(fā).光溫敏雄性不育水稻的研究進展[J].科學(xué)通報，2016，61（35）：3822-3832.

[12]斯華敏，付亞萍，劉文真，等，水稻光溫敏雄性核不育系的系譜分析[J]?.作物學(xué)報，2012， 38（3）：394-407.

（責(zé)任編輯：柯文輝）