莊月娥 陳華觀

摘?要：篩選高產(chǎn)莫納可林K、低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株，為后期紅曲工藝的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。以福建省古田縣不同品牌的紅曲米為原料，分離純化并篩選出高產(chǎn)莫納可林K、低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株。最后，通過單因素試驗(yàn)對純種紅曲的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：通過篩選得到15株（編號為M1～M15）紅曲霉菌，經(jīng)HPLC測定莫納可林K和桔霉素的含量，顯示M8菌株的桔霉素含量為1.40 μg·g-1，莫納可林K含量為3950 μg·g-1，選為最優(yōu)紅曲霉出發(fā)菌種。進(jìn)一步優(yōu)化M8菌株的發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)在pH值4.5、培養(yǎng)溫度25℃和培養(yǎng)時間11 d的情況下，紅曲霉M8菌株的莫納可林K產(chǎn)量最高，可達(dá)4160 μg·g-1。試驗(yàn)篩選得到了1株高產(chǎn)莫納可林K、低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株，擴(kuò)大了高產(chǎn)莫納可林K的菌株選擇。

關(guān)鍵詞：紅曲霉;桔霉素;莫納可林K;發(fā)酵條件

中圖分類號：TS202.3?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）01-0006-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.01.002

Screening of Monascus Strains with High?yielding Monacolin K and

Low?yielding Citrinin and the Optimization of Fermentation Conditions

ZHUANG Yue?e1， CHEN Hua?guan2

（1. Quanzhou Medical College， Quanzhou， Fujian 362000， China; 2. Quanzhou Comprehensive Enforcement

Team of Market Supervision， Quanzhou， Fujian 362000， China）

Abstract： The strains of Monascus with high?yielding monacolin K and low?yielding citrinin were screened， in order to lay a foundation for the later development and application of red koji technology. The different brands of red yeast rice from Gutian County， Fujian Province was used as raw material to isolate and purify the strains of Monascus with high?yielding monacolin K and low?yielding citrinin. Then， the fermentation conditions of pure red koji were optimized by single factor experiment. The results showed that 15 strains （M1-M15） were obtained through screening， and the contents of monacolin K and citrinin were determined by HPLC， indicating that the content of citrinin in M8 strain was 1.40 μg·g-1， and the content of monacolin K was 3950 μg·g-1， which was selected as the optimal starting strain of Monascus. By further optimizing the fermentation conditions of M8 strain， it was found that under the conditions of pH value 4.5， culture temperature 25℃ and culture time 11 d， the content of monacolin K in M8 strain of Monascus was the highest， reaching 4160 μg·g-1. Therefore， a strain of Monascus with high?yielding monacolin K and low?yielding citrinin was screened from the experiment， thus to expand the selection of the strains with high?yielding monacolin K.

Key words： Monascus; Citrinin; Monacolin K; Fermentation conditions

紅曲是紅曲霉菌寄生在大米發(fā)酵后形成，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于釀酒工藝、食醋生產(chǎn)、食品著色劑和防腐劑等方面，是我國重要的傳統(tǒng)食品和中藥材之一[1]。紅曲最早始用于唐代，在中國已有1000多年的應(yīng)用歷史，《本草綱目》中記載有“消食活血、健脾燥胃”等功效。人們常常用其來釀制紅曲酒作為婦女產(chǎn)后調(diào)理使用，主要產(chǎn)地為浙江、福建、臺灣等省份，其中，以福建省古田縣生產(chǎn)的紅曲最具有代表性[2]。

紅曲霉菌在大米發(fā)酵后可以產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物，如紅曲色素、γ?氨基丁酸、抗菌物質(zhì)、莫納可林K（monacolin K）和桔霉素等。1979年Endo等[3]在紅曲霉培養(yǎng)液中分離得到了莫納可林K類活性物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)這類活性物質(zhì)能夠抑制膽固醇合成，有效地調(diào)節(jié)血脂，是一種安全性高、應(yīng)用效果好的血脂調(diào)節(jié)物。1995年，Blanc等[4]在紅曲霉的代謝產(chǎn)物中分離得到了一種真菌桔霉毒素，具有致癌和致畸等作用。因此，利用生物技術(shù)手段選育高產(chǎn)莫納可林K、低桔霉素的紅曲霉菌，對于開發(fā)利用傳統(tǒng)微生物資源具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義[5]。

本試驗(yàn)以福建省古田縣不同品牌的紅曲米為原料，篩選1株生長較好、高產(chǎn)莫納可林K、低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌，并以莫納可林K產(chǎn)量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)對純種紅曲的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為今后開發(fā)利用紅曲霉產(chǎn)品和規(guī)?；a(chǎn)莫納可林K提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

福建省古田縣18種不同品牌紅曲米。

1.2?培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽提取物20 g、蛋白棟10 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL、pH 5.4;種子培養(yǎng)基：蛋白棟25 g、NaNO3 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、K2HPO4 1 g、ZnSO4·7H2O 2 g、甘油100 mL、蒸餾水1000 mL;液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油100 mL、玉米漿20 mL、NaNO3 10 g、C2H3NaO2 10 g、C5H11O2NS 5 g、K2HPO4 5 g、MgSO4·7H2O 2 g、蒸餾水1000 mL。

1.3?主要試劑和儀器

1.3.1?主要試劑?桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品（青島普瑞邦生物工程有限公司），莫納可林K標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所），其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3.2?主要儀器?高效液相色譜儀[沃特世科技（上海）有限公司];Agilent5TCC18（2）色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm（安捷倫科技有限公司）。

1.4?試驗(yàn)方法

1.4.1?分離純化?分別取產(chǎn)地為福建省古田縣的18種不同品牌紅曲米（編號為Q1～Q18）各10 g，放入帶有玻璃珠的90 mL無菌水三角瓶中，搖床培養(yǎng)30 min，此為10

-1濃度菌液，吸取l mL 10-1濃度菌液至9 mL無菌水中，此為10-2 濃度菌液，以此類推，分別依次稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6濃度菌液。分別吸取0.1 mL各梯度濃度菌液，涂布于麥芽汁平板，32℃培養(yǎng)4 d。

從培養(yǎng)基中挑取符合紅曲霉微生物學(xué)特征的菌種進(jìn)行分離純化，轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基進(jìn)行32℃培養(yǎng)4 d，每天在顯微鏡下進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和生物鑒定[6]。

1.4.2?菌株篩選?分別挑取單菌落于麥芽汁培養(yǎng)基32℃培養(yǎng)7 d。接種菌絲于種子液培養(yǎng)基，搖瓶轉(zhuǎn)速120 r·min-1，32℃培養(yǎng)7 d。將種子液1∶20比例接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)10 d。利用HPLC對發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素和莫納可林K進(jìn)行含量測定，初篩選出高產(chǎn)莫納可林K、低產(chǎn)桔霉素的菌株。通過連續(xù)傳代培養(yǎng)檢測其遺傳穩(wěn)定性：于4月開始每隔1個月（共6個月）轉(zhuǎn)接1次斜面，同時進(jìn)行活化培養(yǎng)，測定桔霉素和莫納可林K含量[7]。

1.4.3?M8菌株產(chǎn)莫納可林K發(fā)酵條件的優(yōu)化?以發(fā)酵液莫納可林K的含量為評價指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，因素水平設(shè)計為：（1）發(fā)酵液初始pH 5.5、搖瓶轉(zhuǎn)速120 r·min-1、發(fā)酵溫度25℃的條件下，發(fā)酵時間設(shè)為5、6、7、8、9、10、11、12、13 d;（2）發(fā)酵液初始pH 5.5、搖瓶轉(zhuǎn)速120 r·min-1、發(fā)酵時間10 d的條件下，發(fā)酵溫度設(shè)為20、25、30、35℃;（3）發(fā)酵溫度 25℃、搖瓶轉(zhuǎn)速120 r·min-1、發(fā)酵時間10 d的條件下，發(fā)酵液初始pH值設(shè)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。分別研究上述不同發(fā)酵條件對紅曲霉菌產(chǎn)莫納可林K的影響。

1.5?測定方法

1.5.1?桔霉素的生物鑒定?在45℃左右的條件下，將3 mL含2%酵母膏、4%葡萄糖、0.75%瓊脂培養(yǎng)基與枯草芽孢桿菌混勻，均勻地倒在20 mL 2%硬瓊脂上。取在YES培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)11 d的紅曲霉菌落放在軟瓊脂表面，32℃培養(yǎng)0.5d，測量抑菌圈直徑[8]。

1.5.2?桔霉素含量測定?液相色譜條件[9]，色譜柱：Agilent 5TC?C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）;熒光檢測器：激發(fā)波長331 nm，發(fā)射波長500 nm，流速1.0

mL·min-1;等度洗脫流動相∶甲醇∶純水（磷酸調(diào)pH 4）=55∶45，進(jìn)樣量20μL，柱溫保持28℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取1 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶解于50 mL甲醇溶液中，配制成20 mg·L-1溶液。稀釋成濃度為2、4、6、8、10、12 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)液。

提取方法：2 mL發(fā)酵液，加入4 mL乙醇，60℃水浴1 h，冷卻后，8000 r·min-1離心10 min，取上清液用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾。

1.5.3?莫納可林K含量測定?液相色譜條件[10]，檢測波長238 nm，流速1.0 mL·min-1;梯度洗脫流動相比例：乙腈∶0.1%磷酸緩沖液 （0～6 min，60∶40;6～24 min，60～95∶40～5;26～30 min，95～60∶5～40）進(jìn)樣量10 μL，柱溫保持在35℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取50 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶解于10 mL乙腈溶液中，配制成5 mg·mL-1溶液。吸取2 mL溶液于10 mL容量瓶中，配制成濃度為1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液，再稀釋成濃度為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液。

提取方法：2 mL發(fā)酵液，加入6 mL無水乙醇，500 W超聲20 min，70℃水浴2 h，冷卻后，8000 r·min-1離心10 min，取上清液用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾。

2?結(jié)果與分析

2.1?紅曲霉菌的分離純化

根據(jù)紅曲霉的微生物形態(tài)特征，通過稀釋平板分離法從福建古田紅曲中分離得到了15株紅曲霉菌株，編號為M1～M15。

2.2?紅曲霉菌株的篩選

2.2.1?紅曲霉菌株桔霉素和莫納可林K含量測定?研究表明，枯草桿菌可以作為紅曲霉產(chǎn)桔霉素的指示菌，可利用枯草桿菌對紅曲霉菌進(jìn)行生物鑒定[11]。同時，通過固體發(fā)酵，HPLC測定桔霉素和莫納可林K的含量（表1）。結(jié)果表明，紅曲霉菌產(chǎn)桔霉素是一個普遍現(xiàn)象，且抑菌圈越大，桔霉素含量越高。經(jīng)過初篩，在測試的15株紅曲霉菌中，M8菌株產(chǎn)生的莫納可林K含量最高，桔霉素含量最低。因此，選定M8菌株作為進(jìn)一步研究的出發(fā)菌種。

2.2.2?紅曲霉M8菌株的形態(tài)特征?通過肉眼和顯微鏡觀察32℃培養(yǎng)12 d后M8菌株的微生物形態(tài)特征：菌落呈橙紅色，直徑約35 mm，表面有褶皺和氣生菌絲，邊緣不光滑;菌絲粗細(xì)大體一致，有隔膜、分支，球狀的分生孢子位于菌絲末端，子囊孢子為橢圓形或圓形。

2.2.3?紅曲霉M8菌株的穩(wěn)定性?每隔1個月轉(zhuǎn)接1次斜面，同時活化進(jìn)行紅曲米培養(yǎng)，再測定桔霉素和莫納可林K含量。結(jié)果（表2）顯示，紅曲霉M8菌株的遺傳性比較穩(wěn)定。

2.3?發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1?發(fā)酵時間對紅曲霉M8菌株莫納可林K產(chǎn)量的影響?不同發(fā)酵時間對紅曲霉M8菌株的莫納可林K產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖1所示。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，莫納可林K產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而增加，但發(fā)酵時間到達(dá)11 d以后，就基本上達(dá)到了平衡狀態(tài)。因此，發(fā)酵時間能夠直接影響紅曲霉的生長和莫納可林K的產(chǎn)量。

2.3.2?發(fā)酵溫度對紅曲霉M8菌株莫納可林K產(chǎn)量的影響?不同發(fā)酵溫度條件下紅曲霉M8菌株的莫納可林K產(chǎn)量如圖2所示。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度對莫納可林K產(chǎn)量有較大的影響，隨著發(fā)酵溫度的提高，莫納可林K產(chǎn)量增加，溫度達(dá)到25℃時， 產(chǎn)量達(dá)到最高值，之后產(chǎn)量逐漸降低。因此，最適合M8紅曲霉菌株的發(fā)酵溫度為25℃。

2.3.3?pH值對紅曲霉M8菌株莫納可林K產(chǎn)量的影響?pH是影響紅曲霉生長的關(guān)鍵因素，且紅曲霉是腐生真菌、嗜酸[12]。不同pH對紅曲霉M8菌株莫納可林K產(chǎn)量的影響如圖3所示。從圖3可以發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的增加，紅曲霉M8菌株莫納可林K的產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)pH值為4.5時，紅曲霉M8菌株莫納可林K的產(chǎn)量達(dá)到最高值，之后產(chǎn)量逐漸降低。因此，最適合紅曲霉M8菌株生長的pH值為4.5。

2.3.4?紅曲霉M8菌株在優(yōu)化發(fā)酵條件下的培養(yǎng)效果?在最優(yōu)發(fā)酵條件下（500 mL三角瓶裝大米50 g、物料厚度4 cm），25℃培養(yǎng)11 d，紅曲霉M8菌株中莫納可林K產(chǎn)量最高，可達(dá)4160 μg·g-1。

3?討論與結(jié)論

本研究從不同來源的福建古田紅曲米中，分離純化得到15株（編號為M1～M15）紅曲霉菌株，經(jīng)過對上述品種紅曲霉菌發(fā)酵后的桔霉素和莫納可林K進(jìn)行含量測定，初步篩選得到了1株高產(chǎn)莫納可林K、低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉M8菌株作為最優(yōu)紅曲霉菌。對M8菌株的發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其在pH值4.5、培養(yǎng)溫度25℃和培養(yǎng)時間11 d的情況下，莫納可林K產(chǎn)量最高，可達(dá)4160 μg·g-1。從試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，桔霉素和莫納可林K的質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要由紅曲霉菌種本身決定。發(fā)酵條件對上述兩種物質(zhì)的產(chǎn)量也有較大的影響。

研究表明，莫納可林K是一種優(yōu)良的次生代謝物，除了有調(diào)節(jié)血脂、降低血壓、抑制膽固醇等功能，同時，在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、膽結(jié)石預(yù)防治療和抗腫瘤等方面亦能發(fā)揮有效地作用[13]。當(dāng)前，人們對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的莫納可林K等研究還處于初級階段，利用紅曲霉規(guī)?；a(chǎn)莫納可林K的同時有效降低桔霉素含量，需要在優(yōu)勢菌株篩選方面取得進(jìn)一步突破[14-15]。下一步，將通過物理、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合等手段，對篩選出的M8紅曲菌株進(jìn)行菌種改良，為低桔霉素、高比例莫納可林K紅曲工藝的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）