蔣增海，王成龍，宋 浩，鄧同煒，唐光武，夏艷勛

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

腸外致病性大腸桿菌(ExtraintestinalPathogenicEscherichiacoli,ExPEC)是一類能引起人和動物腸外組織感染的重要人畜共患病病原，可致使不同宿主發(fā)生腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染[1]。動物源ExPEC 具有人畜共患的特性，給人類的健康造成了潛在的威脅[2]。有研究表明，ExPEC的抗生素耐藥性明顯高于其它菌群，50%以上菌株屬多重耐藥菌株，許多菌株已演化成超級耐藥細菌，較難選擇有效的抗生素對該類菌群引起的疾病進行防控[1]。目前，豬大腸桿菌病在臨床上的病型，主要分為黃痢型、白痢型和水腫型[3]，致多發(fā)性漿膜大腸桿菌病很少報道。2019年5月份，河南省南陽市某自繁自養(yǎng)的小型豬場，斷奶后的保育仔豬發(fā)病，表現(xiàn)為精神不振、消瘦、被毛粗亂、腹式呼吸、拉稀等癥狀，筆者采集病料，通過細菌分離、鑒定和藥敏試驗，獲得1株致多發(fā)漿膜炎豬腸外致病性大腸桿菌，藥敏試驗表明，該分離菌株十分耐藥，僅對少數(shù)藥物敏感，豬群經(jīng)過敏感藥物治療，病情好轉(zhuǎn)，本次診治經(jīng)驗?zāi)転樨i場獸醫(yī)臨床提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

樣品來自發(fā)病的仔豬。保育仔豬存欄110多頭，斷奶后陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病率約為20%-30%，發(fā)病已有1周時間，死亡4頭仔豬，發(fā)病后用阿莫西林、環(huán)丙沙星、泰樂菌素拌料，均不見效，病情越來越嚴重。

1.2 材料與試劑

胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)購自美國BD公司，麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物有限公司，MH瓊脂、MH肉湯購自英國Oxoid公司；腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管 CYZ-15e和配套試劑均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；10×EX Taq PCR Buffer(Mg2+ Plus)、dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq 購自TaKaRa公司；BM2000 DNA Marker購自北京博邁德生物基因技術(shù)有限公司；各種藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；健康昆明小鼠由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物房購置。

1.3 細菌分離

先將剪刀、鑷子火焰灼燒消毒，使用75%酒精棉球擦拭心臟、肝臟表面，點燃酒精棉球，在肝臟、心臟表面引火自燃消毒，保證無雜菌污染，剪去肝臟表面組織，取深部組織，剪開心臟，滅菌棉簽取心血，分別稀釋劃線接種于加有一定量血清和V因子的胰蛋白酶胨大豆瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)12h-24h，挑取典型菌落，再接種麥康凱瓊脂平板，進一步純化2-3代。

1.4 染色鏡檢

取潔凈玻片一張，在玻片中央滴一滴蒸餾水，挑取純化的單菌落，與蒸餾水混勻，自然干燥后，火焰固定，再使用革蘭氏快速染色液，按照說明書染色，油鏡下觀察細菌形態(tài) 。

1.5 生化試驗

進行生化試驗，并根據(jù)生化試驗的結(jié)果，按照腸桿菌科細菌生化鑒定編碼手冊要求，檢索細菌鑒定的結(jié)果。

1.6 PCR鑒定

參照文獻[4],合成一對大腸桿菌PCR擴增特異性引物，其序列為E.coli-1：5′-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3′,E.coli-2：5′-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3′，擴增大小約為264 bp特異性片段。水煮沸提取細菌的DNA模板。按照TaKaRa Ex Taq試劑的說明書，進行分離菌株的PCR擴增；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，總共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物由1%瓊脂糖進行電泳，然后由DAN凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。

1.7 小鼠致病性試驗

健康昆明小鼠10只，隨機分為兩組，每組各5只，一組為實驗組，一組為對照組。實驗組，先將分離菌株培養(yǎng)的新鮮菌液，進行一定稀釋，每只小鼠腹腔接種稀釋菌液0.2mL,同時進行細菌平板計數(shù)。對照組，每只小鼠腹腔接種PBS 0.2 mL。

1.8 藥敏試驗

以大腸桿菌 (ATCC25922)為質(zhì)控菌株，按照世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的K-B法進行藥敏試驗，參照文獻[5-6]判讀分離菌株對各種藥物的耐藥情況。

2 結(jié)果

2.1 病豬的主要病理變化

送檢4頭病豬的剖解病變一致，頜下淋巴結(jié)腫大、出血，腹股溝淋巴結(jié)腫大、出血(圖1)，腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血，肺臟充血、出血；胸、肺粘連，心包增厚，心外膜表面覆蓋有大量纖維素性物質(zhì)，呈“絨毛心”(圖2)；肝周炎，肝臟表面覆蓋大量纖維素性物質(zhì)，小腸表面覆蓋大量纖維素性物質(zhì)(圖3)，表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎。

圖1 腹股溝淋巴結(jié)腫大、出血

圖2 心包增厚，“絨毛心”

圖3 心、肝和腸覆蓋大量纖維素性物質(zhì)

2.2 細菌分離結(jié)果

無菌采集肝臟或者心血，接種于加有一定血清和V因子的TSA平板，37℃培養(yǎng)12h，生長為圓形、濕潤、半透明、凸起、大小約為1-2mm的菌落，菌落形態(tài)一致，眼觀比較純(圖4)；挑取典型的菌落，接種于麥康凱瓊脂平板，進一步純化，生長為圓形、粉紅色、濕潤的菌落。

2.3 染色鏡檢結(jié)果

采用革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察，呈可見革蘭氏陰性、中等大小、無芽孢的短小桿菌(圖5)。

圖4 分離菌株在TSA平板的菌落形態(tài)

圖5 分離菌株染色鏡檢形態(tài)

2.4 生化試驗結(jié)果

按照廠家說明書操作，生化試驗結(jié)果如表1所示，根據(jù)腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊檢索結(jié)果，表明分離菌株為大腸埃希菌。

表1 分離菌株生化試驗結(jié)果

注：+:陽性；-:陰性；○+:產(chǎn)酸產(chǎn)氣

2.5 PCR鑒定結(jié)果

使用大腸桿菌特異性PCR擴增引物，對分離菌株進行PCR鑒定。PCR擴增結(jié)果顯示，分離菌株與大腸桿菌陽性對照擴增結(jié)果一致，均擴增出264 bp條帶，而去離子水作為陰性對照，未擴增出條帶(圖7)，表明分離菌株為大腸桿菌。

圖6 分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果注：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(BM2000)；1、2：分離菌株；3、陰性對照

2.6 小鼠致病性試驗結(jié)果

細菌平板計數(shù)結(jié)果表明，每只小鼠接種分離菌株的菌量為4.5×107CFU。接種后12-18h 內(nèi)，實驗組所有小鼠均死亡；對照組無死亡，全部健康。將死亡的小鼠，無菌采集心血或者肝臟，接種麥康凱瓊脂平板，能分離出大腸桿菌。本試驗表明,分離大腸桿菌對小鼠具有致病性，說明該菌株不是繼發(fā)感染菌株或者污染的雜菌。

2.7 藥敏試驗

藥敏結(jié)果顯示,分離菌株對阿米卡星、多粘菌素、美羅培南、亞胺培南敏感，對卡那霉素中介，對慶大霉素、恩諾沙星、強力霉素、氨芐西林、磺胺類藥物、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑啉等均耐藥。

表1 藥敏試驗結(jié)果

注：S:敏感；I:中介；R:耐藥

3 討論

送檢病豬表現(xiàn)為消瘦、生長緩慢、腹式呼吸等癥狀，剖解病變?yōu)樾陌弧⑿厍缓透骨坏葍?nèi)臟組織表面充滿大量纖維素性物質(zhì)，很容易將其誤診為副豬嗜血桿菌病。采用加有一定量血清和V因子的胰蛋白酶大豆瓊脂平板分離細菌，其目的是判斷本病是否由副豬嗜血桿菌引起。細菌分離結(jié)果分離到圓形、半透明、生長一致、外觀比較純的大腸桿菌菌落，無副豬嗜血桿菌菌落生長。根據(jù)臨床經(jīng)驗，副豬嗜血桿菌生長緩慢，在TSA平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h左右，不可能生長為1-2 mm大小的菌落。豬鏈球菌也可以導(dǎo)致漿膜炎型[7]，但是鏈球菌在TSA平板上，生長24-48 h，菌落針尖大小，約為0.5-1 mm，明顯小于大腸桿菌菌落。最后，根據(jù)病原菌分離鑒定和小鼠致病性試驗，將本次送檢病豬診斷為豬大腸桿菌病。試驗表明，腸外致病性大腸桿菌，能夠?qū)е仑i發(fā)生多發(fā)性漿膜炎，尤其肝臟覆蓋纖維素性物質(zhì)，與以前文獻報道的結(jié)果一致[8]。

藥敏試驗結(jié)果表明，該大腸桿菌臨床分離株耐藥性十分嚴重，呈嚴重多重耐藥性，特別是對頭孢菌素類藥物都耐藥，如果該菌株，通過食物或者飲水感染人類，造成頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑啉等治療無效，嚴重威脅人類健康；對獸醫(yī)臨床上的常用藥物如氨芐西林、慶大霉素、恩諾沙星、強力霉素、磺胺類藥物等均耐藥，并且對臨床上禁用藥氯霉素也耐藥，推測對臨床上常用的氯霉素的同類藥氟苯尼考也可能會耐藥；僅僅對美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、多粘菌素敏感。

阿米卡星、美羅培南、亞胺培南屬于醫(yī)用藥物，本次病例，選用硫酸黏菌素注射液治療，按照一次量，每1 Kg體重，肌內(nèi)注射2-4 mg，每天1次，連用3天后，病情得到好轉(zhuǎn)。這表明，目前獸醫(yī)臨床上細菌耐藥性問題已經(jīng)十分嚴重，豬病發(fā)生后，采集病料，分離病原菌，進行藥敏試驗，十分必要。