王秀玲，李曉怡，盧婷婷，李艷玲

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南 鄭州 450046)

野菊花又稱野黃菊花、苦薏，是一類中草藥。早在3000多年前，我國就已經(jīng)開始種植野菊花并且將其制成藥材使用，是我國傳統(tǒng)的藥食兼優(yōu)的花卉[1]。野菊花的生長要求不高，主要分布于中北部地區(qū)，常見其生長于田邊、山坡草地、路邊等[2]。野菊花性涼，具有很好的清熱去火效果[3]。野菊花還有很好的抗菌消炎、保肝明目、疏散風(fēng)寒、抗氧化、抗衰老乃至抗腫瘤等作用[4-5]。野菊花中的藥理成分主要為黃酮類化合物、揮發(fā)油類和萜類、棕櫚酸、多糖、葉綠素等[6]。黃酮類化合物包括蒙花苷、木犀草素和葡萄糖苷[7]。蒙花苷具有很好的抗氧化抗衰老以及抑制血糖升高等作用[8-9]，而木犀草素能夠抑制癌細(xì)胞的增殖分裂和擴散，達(dá)到抗腫瘤的作用[10]。揮發(fā)油和萜類還可以使血管舒張血壓降低[11]。

GRF因子是存在于植物中的一種調(diào)控其生長發(fā)育的物質(zhì)[12]。OsGRF1是GRF家族的第一個成員，之后便不斷有其他物種的GRF成員被研究出來[13]。據(jù)報道，擬南芥和油菜中分別有9個GRF成員和34個GRF成員[14]，水稻和楊樹中分別有12個和19個GRF成員[15]。GRF蛋白是植物在DNA結(jié)合過程中起特異性靶向作用的部分[16]。GRF因子能夠使植物細(xì)胞不斷增殖分裂達(dá)到器官增大的目的，調(diào)控其生長[17]。GRF因子大量存在于在植物的根尖、嫩綠的葉片和剛發(fā)芽的嫩芽中，它可以調(diào)控細(xì)胞體積大小、葉片生長，刺激葉綠體分裂或者延長細(xì)胞分裂周期，使葉綠體數(shù)量增加，延緩葉片衰老，參與氮信號傳導(dǎo)和光合作用[18]。

本試驗對野菊花GRF基因家族各個成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、基因結(jié)構(gòu)分析、潛在磷酸化位點預(yù)測和擬南芥中GRF基因家族之間的進化關(guān)系分析等，旨在為進一步研究野菊花中GRF基因家族的功能與作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料基因序列的獲取

從擬南芥官網(wǎng)(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥的全基因組蛋白序列和擬南芥的9個GRF家族成員的蛋白序列，從野菊花官網(wǎng)(http://www.amwayabrc.com/zh-cn/index.html)下載野菊花的全基因組蛋白序列。

1.2 野菊花GRF基因家族成員的鑒定

參照擬南芥官網(wǎng)中的9個GRF基因的ID號，用Fasta Extractor將擬南芥中的9個GRF基因蛋白序列提取出來；利用Blast軟件，對比擬南芥的9個GRF基因的蛋白序列，從野菊花全基因組的蛋白質(zhì)序列中篩選出擬南芥GRF基因家族在野菊花中的同源基因，得到15個野菊花的GRF家族成員，再運用Fasta Extractor工具將得到的同源基因蛋白序列提取出來。

1.3 野菊花GRF基因家族成員的基本特性及進化分析

1.3.1 野菊花GRF基因家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

運用ProtParam在線分析工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析野菊花GRF家族蛋白質(zhì)的各種理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點等。

1.3.2 野菊花GRF基因家族的亞細(xì)胞定位

運用Plant-mPLoc分析工具(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)在線預(yù)測GRF蛋白家族成員的亞細(xì)胞定位。

1.3.3 野菊花GRF基因家族成員和擬南芥GRF家族成員的進化樹構(gòu)建

為了解野菊花GRF基因家族和擬南芥基因家族的進化關(guān)系，運用MUCLE在線分析網(wǎng)站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)對野菊花GRF基因家族成員進行多序列比對，采用IQ-TREE(http://www.iqtree.org/tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg#)在線構(gòu)建野菊花GRF基因家族的進化樹。

1.3.4 野菊花GRF基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析

將得到野菊花的15個GRF家族成員的基因序列處理之后，運用GSDS網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線分析野菊花GRF基因家族的基因結(jié)構(gòu)，即內(nèi)含子和外顯子。

1.3.5 野菊花GRF基因家族的結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

利用Home-PMC-NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)網(wǎng)站在線分析野菊花GRF基因的保守結(jié)構(gòu)域。運用MEME在線網(wǎng)址(http://meme-suite.org/tools/meme)分析GRF家族成員的保守基序，并設(shè)置20個基序。

1.3.6 野菊花GRF基因家族的潛在磷酸化位點預(yù)測

運用軟件NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)在線分析野菊花GRF蛋白家族成員的潛在磷酸化位點，參數(shù)均采用系統(tǒng)默認(rèn)值。

1.3.7 野菊花GRF基因家族的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

利用在線二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對野菊花GRF蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)進行分析，分析內(nèi)容包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈等。

2 結(jié)果與分析

2.1 野菊花GRF基因家族的鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

對比擬南芥的9個GRF基因家族成員的蛋白序列，利用TBtools工具對野菊花GRF基因家族進行Blast比對篩選，得到15個野菊花GRF基因家族成員，并根據(jù)與GRF結(jié)構(gòu)域匹配程度分別命名為ChrGRF1-ChrGRF15。利用Protparam工具在線分析這些基因家族成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，如氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點等(見表1)。分析發(fā)現(xiàn)，15個GRF基因家族蛋白質(zhì)各成員的氨基酸數(shù)量均有所不同，大多數(shù)介于250-548個之間。其中氨基酸長度最長的是ChrGRF2蛋白，氨基酸個數(shù)為883個；而 ChrGRF10蛋白和ChrGRF15蛋白的氨基酸數(shù)量較少，氨基酸個數(shù)分別為139個和138個。對等電點的分析發(fā)現(xiàn)，野菊花GRF蛋白家族的等電點在6.78-9.48之間，差距不大，除了ChrGRF1蛋白的等電點為6.78外，另外14個野菊花GRF蛋白家族成員的等電點都在7以上，此現(xiàn)象表明這些GRF蛋白家族成員可能含有較多的堿性氨基酸。這些蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在15.5kDa-100.4kDa不等。通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，所有GRF蛋白家族成員均定位在細(xì)胞核。ChrGRF10蛋白和ChrGRF15蛋白除了定位在細(xì)胞核外，還分別定位在細(xì)胞膜、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體上，說明這兩個成員還會發(fā)揮其他不同作用。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表

2.2 野菊花GRF基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析和進化樹構(gòu)建

用GSDS2.0在線系統(tǒng)得到15個野菊花GRF基因家族的基因結(jié)構(gòu)及9個擬南芥GRF基因家族的基因結(jié)構(gòu)，運用MUSCLE和IQ-TREE在線得到野菊花和擬南芥GRF基因家族成員的進化關(guān)系，將得到的基因結(jié)構(gòu)圖和進化樹圖用軟件進行拼接，如圖1所示。分析發(fā)現(xiàn)，在野菊花GRF基因家族中，ChrGRF12、ChrGRF14、ChrGRF15這3個家族成員含有的蛋白質(zhì)編碼區(qū)最少，數(shù)量為2個，ChrGRF5-ChrGRF10這6個家族成員均含有3個蛋白質(zhì)編碼區(qū)，ChrGRF3、ChrGRF4、ChrGRF11、ChrGRF13這4個家族成員含有4個蛋白質(zhì)編碼區(qū)，ChrGRF1基因含有6個蛋白質(zhì)編碼區(qū)，而ChrGRF2基因的蛋白序列最長，數(shù)量為10個，結(jié)合進化樹和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果，這個成員與其它家族的進化關(guān)系相差較遠(yuǎn)，發(fā)揮的功能也會有較大差異。這些家族成員之間所含有的外顯子數(shù)量均有所不同，但親緣關(guān)系較近的成員之間差異不是很大。由進化樹可知，ChrGRF3、ChrGRF15和擬南芥的AtGRF1、AtGRF2、AtGRF9這三個家族成員親緣關(guān)系比較相近，基因結(jié)構(gòu)也相差不大。ChrGRF1和ChrGRF2各自單獨成簇，推測這兩個成員發(fā)揮的功能可能與其它成員具有較大差異。

圖1 GRF家族成員在野菊花和擬南芥中的進化分析和基因結(jié)構(gòu)分析

2.3 野菊花GRF基因的保守結(jié)構(gòu)域

通過Home-PMC-NCBI在線分析網(wǎng)站分析野菊花GRF基因家族保守結(jié)構(gòu)域，然后用TBtools工具構(gòu)建保守結(jié)構(gòu)域圖。據(jù)報道，GRF基因家族含有兩個保守結(jié)構(gòu)域，即WRC和QLQ結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明，野菊花GRF基因家族成員均含有WRC結(jié)構(gòu)域，說明WRC結(jié)構(gòu)域是非常保守的，在家族進化過程中幾乎沒有太大變動，這印證了WRC結(jié)構(gòu)域在植物生長發(fā)育中所發(fā)揮的功能。其中ChrGRF3、ChrGRF4、ChrGRF5、ChrGRF6、ChrGRF7、ChrGRF8、ChrGRF9、ChrGRF11、ChrGRF13、ChrGRF15這10個成員不僅含有WRC這個結(jié)構(gòu)域，還含有QLQ結(jié)構(gòu)域。而ChrGRF1、ChrGRF2、ChrGRF12、ChrGRF14這四個成員雖不含QLQ結(jié)構(gòu)域，但含有WRC結(jié)構(gòu)域和其他結(jié)構(gòu)域，由此推測這幾個家族成員蛋白質(zhì)功能具有多樣性。

2.4 野菊花GRF蛋白家族成員的磷酸化修飾位點預(yù)測

生物體通過磷酸化產(chǎn)生ATP為自身提供能量，所以磷酸化所發(fā)揮的作用對于生物體來說至關(guān)重要。運用軟件NetPhos 3.1 Server在線分析預(yù)測野菊花的15個GRF蛋白家族成員的潛在磷酸化位點，由表1可知，野菊花GRF蛋白家族成員均含有潛在的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的磷酸化位點。磷酸化位點個數(shù)最多的為絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸的個數(shù)較少，且兩種氨基酸位點個數(shù)相差不大，其中ChrGRF2蛋白中絲氨酸的磷酸化位點最多，達(dá)到81個，其潛在磷酸化位點總數(shù)也是最多的一個，為137個；而ChrGRF15蛋白潛在磷酸化位點總數(shù)則最少，為26個。

2.5 野菊花GRF基因家族蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)分析

運用蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件SOPMA對野菊花GRF蛋白序列的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈等進行在線分析，如圖3所示，野菊花GRF蛋白家族的成員全部都包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈等部分，但各部分所占比例明顯不同。由表1可知，GRF蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是由無規(guī)則卷曲組成，除了ChrGRF2蛋白的無規(guī)則卷曲比例為45.53%外，其余均在50%以上，其次分別為α-螺旋和延伸鏈，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最低，均在7%以下。

3 結(jié)論

野菊花是一種應(yīng)用價值較高的植物，具有抗菌消炎、清熱去火、抗腫瘤、抗衰老等一系列藥理作用，其治療效果也頗為顯著。GRF是調(diào)控植物生長發(fā)育的關(guān)鍵因子。目前已經(jīng)鑒定出許多植物的GRF基因家族的成員，包括擬南芥、水稻、番茄等，其中對于擬南芥GRF基因家族人員的研究最為透徹，關(guān)于GRF基因的功能也做出了許多研究。本試驗通過對比擬南芥GRF基因家族蛋白序列,對野菊花GRF基因家族成員進行篩選，然后對野菊花GRF基因家族成員進行一系列理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和保守結(jié)構(gòu)域分析及進化分析，為進一步研究野菊花GRF基因家族成員的作用及其功能提供必要的理論基礎(chǔ)。

本研究利用TBtools中的Blast軟件對比擬南芥GRF基因家族成員蛋白序列，鑒定出了15個野菊花GRF家族成員，對這15個成員進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，ChrGRF2蛋白的氨基酸數(shù)量最多，達(dá)到883個。亞細(xì)胞定位顯示它們在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。對擬南芥的9個GRF基因家族成員和野菊花的15個GRF家族成員進行進化樹分析發(fā)現(xiàn)，ChrGRF1和ChrGRF2這兩個成員與其它成員的親緣關(guān)系相差都非常遠(yuǎn)，而且它們的蛋白序列和基因結(jié)構(gòu)都比較長，其中ChrGRF2的蛋白序列和基因結(jié)構(gòu)最長。同時，ChrGRF15和AtGRF9、ChrGRF3和AtGRF1、AtGRF2親緣關(guān)系最為相近，其基因結(jié)構(gòu)也較為相似，發(fā)揮的功能也相似。通過分析GRF蛋白的保守基序可以發(fā)現(xiàn)，Motif1和Motif2這兩個基序比較保守，它們所含有的保守基序種類也與其他成員不同，這兩個成員共同含有Motif9、Motif12、Motif18、Motif20四個基序。通過潛在磷酸化位點定位分析發(fā)現(xiàn)，這些家族成員中含有的磷酸化位點個數(shù)最多的是絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸的個數(shù)相差不大，但都比絲氨酸個數(shù)要少。分析這些家族成員的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲組成，其次為α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角，其中ChrGRF1和ChrGRF2的氨基酸數(shù)量和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大，α-螺旋數(shù)量也最多，β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈則沒有較大變化，推測α-螺旋結(jié)構(gòu)的數(shù)量可能與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量存在一定的正比例關(guān)系。