李雨衡 林仁露 劉泉

摘要：目的為了使在犯罪現(xiàn)場提取的微量有污染的DNA可以被準確檢測出來。方法通過使用全血樣本，在進行PCR直擴過程中加入DMSO或BSA，并測序后得出最后結(jié)果，比較兩種試劑的增強效果。結(jié)果兩種方法都不同程度的提高了DNA的擴增量，使其檢出率大大提高了。結(jié)論2mg/ml的BSA，0.4mg/ml的DMSO很大程度的提高了DNA的擴增量和檢出率。

關(guān)鍵詞：全血樣本;血紅素;PCR;STR;DMSO;BSA

作為目前法醫(yī)物證檢驗鑒定的常規(guī)技術(shù)，對生物檢材中的DNA進行擴增是DNA分型中的一個重要環(huán)節(jié)，而要使DNA分型能夠順利進行，就必須提高PCR擴增的高效性和靈敏性。在刑事案件現(xiàn)場收集到的DNA檢材通常會有一定的污染，其會使檢材無法被準確檢測出來，這也是PCR擴增失敗的主要原因。

目前，血液中的血紅素已被證實為PCR抑制物之一[1]，而血液作為刑事案件中常見的生物檢材，在PCR領域中具有較高的研究價值。當前，國內(nèi)外學者的大量研究以及法醫(yī)學的大量實踐可證實，一定濃度的DMSO或者BSA可提高DNA擴增量，但超過一定濃度也會導致PCR擴增效率的降低，且它們的濃度數(shù)值關(guān)系研究得不夠清楚。盡管市場上已存在很多全血直擴試劑盒，但由于對相關(guān)促進PCR擴增試劑濃度數(shù)值關(guān)系的不確定，造成其擴增效力也不盡相同。通過本次課題研究，對比出DMSO和BSA對PCR擴增的影響大小，以及各個合適濃度值來作為PCR增強劑。

1 材料

1.1 檢材提取

采血前讓志愿者洗凈雙手，并用70%乙醇溶液消毒。用采血器采血后用吸血器吸取，然后滴取在已消毒的濾紙上。標明姓名和時間。

1.2 儀器

（1）分析天平。

（2）移液器。

（3）震蕩儀。

（4）打孔器。

（5）純水儀。

（6）高速離心機。

（7）7500PCR擴增儀（由美國應用生物系統(tǒng)公司提供）。

（8）3500測序儀（由美國應用生物系統(tǒng)公司提供）。

1.3 試劑

（1）A27plex試劑盒。

（2）BSA（10mg/ml）。

（3）DMSO（1.1mg/ml）。

（4）Taq DNA聚合酶。

（5）甲酰胺。

（6）Ladder。

（7）Liz內(nèi)標。

1.4 主要試劑配制

（1）BSA：分別取0.01g、0.02g、0.03g、0.04gBSA于2mlEP管中，加入純水至2ml。使其濃度依次為5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。

（2）DMSO：取濃度為1.1g/ml的DMSO2ml分裝在2mlEP管中。

2 實驗方法

2.1 PCR擴增步驟

2.1.1 DMSO實驗的擴增前的實驗步驟

（1）在帶有血樣的濾紙上標上姓名及采血時間后待其晾干。

（2）取0.2mlEP管6個放置于孔板上。

（3）用已消毒的打孔器在有血樣的濾紙片上打孔（每次一下），將所得血樣粒放入0.2mlEP管中，每個EP管中放置兩粒。

（4）取1個0.2mlEP管放置在孔板上。

（5）取24μLMix，12μLPrimer，2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中，并置于震蕩器混勻。

（6）將最大量程為10μL的移液器調(diào)至6.4μL，將（2）中混合液取6.4μL，分裝于6個含有血樣的0.2mlEP管中。

（7）將6個0.2ml1EP管分別標號為HO（對照）、HD0.2、HD0.4、HD0.6、陰性和陽性。

（8）然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μLddH2O、3.6μLddH2O、1μL DNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。

（9）將其放置于高速離心機中以4930rpm速率離心10秒。

2.1.2 BSA實驗的擴增前的實驗步驟

（1）在帶有血樣的濾紙上標上姓名及采血時間后待其晾干。

（2）取0.2mlEP管6個放置于孔板上。

（3）用已消毒的打孔器在有血樣的濾紙片上打孔（每次一下），將所得血樣粒放入0.2mlEP管中，每個EP管中放置兩粒。

（4）取1個0.2mlEP管放置在孔板上。

（5）取24μLMix，12μLPrimer，2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中，并置于震蕩器混勻。

（6）將最大量程為10μL的移液器調(diào)至6.4μL，將（2）中混合液取6.4μL，分裝于6個含有血樣的0.2mlEP管中。

（7）將6個0.2ml1EP管分別標號為HO（對照）、HD0.2、HD0.4、HD0.6、陰性和陽性。

（8）然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μL ddH2O、36μLddH2O、1μLDNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。

（9）將其放置于高速離心機中以4930rpm速率離心10秒。

2.2 PCR擴增熱循環(huán)參數(shù)

（1）95℃預變性2min;

（2）94℃10s，60℃1.5min，循環(huán)28次;

（3）60℃延伸20min;

（4）4℃保溫。

2.3 測序步驟

2.3.1 DMSO實驗的測序的實驗步驟

（1）取72μL甲酰胺，1.6μL Liz于0.2mlEP管中，并用移液器吹打若干次。

（2）將最大量程為10μL的移液器調(diào)至9.2μL，并將（1）中混合液按照順序以9.2μL分裝至96孔板中。

（3）順次加入1μL Ladder，1μL 陽性對照，1μL陰性對照，1μLH0，1μLHD0.2，1μLHD0.4，HD0.6。

（4）將孔板蓋好后放入平板高速離心離心機中以4930rpm速率離心30秒后取出。

2.3.2 BSA實驗的測序前的實驗步驟

（1）取81μL甲酰胺，1.8μL Liz于0.2mlEP管中，并用移液器吹打若干次。

（2）將最大量程為10μL的移液器調(diào)至9.2μL，并將（1）中混合液按照順序以9.2μL分裝至96孔板中。

（3）順次加入1μL Ladder，1μL陽性對照，1μL陰性對照，1μLH0，1μLHB0.5，1LHB1.0，HB1.5，HB2.0，HB3.0，HB6.0，HB9.0。

（4）將孔板蓋好后放入平板高速離心離心機中以4930rpm速率離心30秒后取出。

3 實驗結(jié)果

由于基因峰值升降趨勢大致相同，故隨機抽取三對堿基：D7S820，D18S51，D8S1179為例進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

3.1 DMSO對全血PCR擴增效率影響的實驗結(jié)果

3.1.1 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計表（如表1所示）

3.1.3 實驗結(jié)果分析

根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)可得，當DMSO體積分數(shù)為0至4%時，DMSO對全血樣本PCR擴增效率隨著DMSO體積分數(shù)的升高而升高;當DMSO體積分數(shù)為4%至6%時，DMSO對全血樣本擴增效率隨著DMSO體積分數(shù)的升高而降低。其中，根據(jù)統(tǒng)計圖中峰值可判斷出DMSO對提升全血樣本擴增效率的最適體積分數(shù)是在4%，由此得出關(guān)于DMSO的一種增強劑為0.4mg/ml的DMSO。

3.2 BSA對全血PCR擴增效率影響的實驗結(jié)果

3.2.1 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計表（如表2）

3.2.3 實驗結(jié)果分析

根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)可得，當BSA濃度為0至2mg/ml時，BSA對全血樣本PCR擴增效率隨著BSA濃度升高而升高;當BSA濃度為3至9mg/ml時BSA對全血樣本PCR擴增效率基本進入平臺期。其中，當BSA為2mg/ml時全血樣本PCR擴增效率最為明顯，由此得出關(guān)于BSA的增強劑為2mg/ml的BSA。

3.3 組間實驗結(jié)果分析

根據(jù)表1、2的實驗數(shù)據(jù)，可得當DMSO體積分數(shù)為4%、BSA濃度為2mg/ml分別對應提高全血PCR擴增效率的最佳濃度。

對于上述統(tǒng)計結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種不同的增強劑對于不同的基因鏈條擴增效果的影響不同，但相對于空白組H0都較大程度增加了DNA的擴增量。從局部來看，單獨使用BSA（HB2.0）的效果普遍獲得的堿基數(shù)量針對基因D7S820擴增量是最高的，遠遠超過DMSO（HD0.4），但對于剩余兩組基因單獨使用DMSO（HD0.4）要比BSA（HB2.0）擴增所得的堿基數(shù)量要高一些，由此無法對比出兩者對于PCR反應的影響大小。

4 討論

4.1 兩種試劑對全血PCR效率影響的實驗分析

由于本實驗采用四色熒光測序，并且根據(jù)最終實驗結(jié)果來看，DNA峰值升降趨勢相同，因此以每一組熒光所代表的堿基對為單位，從每一組熒光測序組中隨機選擇一對堿基進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

4.1.1 對加入DMSO的實驗分析

DMSO是一種無色無味透明液體，有吸水性，分子式為，見圖4。分子含有一個極性非常高的鍵和兩個相同的非極性基團，因此，它既可溶于非極性溶劑又可溶于極性溶中，因為這種物理化學特性，可以作為一些不溶于水的化合物的有效溶劑，并且可以破壞水分子之間的氫鍵。工業(yè)上被用于溶劑和萃取劑。在生物學研究中，它可以作為一個優(yōu)良的溶劑，而在醫(yī)藥治療中，它可以作為有效的溶媒介物，因此可以用于PCR整個反應體系使之充分混合，同時DMSO也作為變性劑可直接解除模板DNA的局部二級結(jié)構(gòu)，從而增加引物和模板的特異性結(jié)合，降低非特異性結(jié)合，最終獲得滿意的擴增效果。

在徐葵，邱志明，汪曉英《DMSO對PCR擴增反應的影響》一文中[3]，受解決δ受體基因?qū)掖问?，從而使用體積分數(shù)為6%至13%DMSO時，使其順利擴增的啟發(fā)。將預實驗中DMSO的體積分數(shù)分別定為6%，8%和10%。但實際操作中，用體積分數(shù)為6%，8%和10%的DMSO進行實驗的實驗結(jié)果表示，當DMSO體積分數(shù)超過6%時，會對全血樣本PCR的擴增效率起到抑制作用。因此，以6%的體積分數(shù)為界限，研究體積分數(shù)為2%，4%，6%時對實驗結(jié)果的影響。

通過對表1和圖1的實驗數(shù)據(jù)進行分析可得，當DMSO體積分數(shù)為2%至4%時，全血PCR擴增效率逐漸升高，在其體積分數(shù)為4%時達到峰值;其體積分數(shù)超過4%后，全血PCR擴增效率逐漸降低?？煞治龀?，對A21plex試劑盒而言，當DMSO體積分數(shù)小于4%時，可直接接觸全血DNA模板的局部二級結(jié)構(gòu)，加強引物和全血DNA模板的特異性結(jié)合;當DMSO體積分數(shù)大于4%時，DMSO會對Taq DNA聚合酶產(chǎn)生抑制作用。而Taq DNA聚合酶作為PCR擴增所需材料，一旦其失去活性，會導致PCR擴增效率的下降。