余慶　劉明珠　李夢夢　肖賀賀　韋信賢　童桂香　吳思婷　李鵬飛

摘要：【目的】篩選出能高特異性和高親和性識別草魚呼腸孤病毒（GCRV）感染細胞的核酸適配體，為研發(fā)操作便捷、成本低、耗時短、準確度高的GCRV檢測技術打下基礎，同時為提高水產(chǎn)疫病檢測及防控效率提供技術支持?！痉椒ā恳圆蒴~呼腸孤病毒I型（GCRVI）感染的宿主細胞為靶標，采用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）進行特異性核酸適配體篩選，并通過激光共聚焦顯微技術和流式細胞術對篩選獲得的核酸適配體性質進行系統(tǒng)分析?！窘Y果】篩選獲得的核酸適配體GVIK1能特異性識別并結合在GCRVI感染的草魚腎臟組織細胞系（CIK）表面，但不識別正常的CIK細胞及石斑魚神經(jīng)壞死病毒廣西株（GNNV）感染的石斑魚脾細胞（GS）;其二級結構具有獨特復雜的莖環(huán)結構，吉布斯自由能（△G）為-32.93 kJ/mol，無細胞毒性。核酸適配體GVIK1結合靶標細胞的親和常數(shù)（Kd）為148.22 nmol/L，即核酸適配體GVIK1與靶標細胞間的親和力極強，達納摩爾級別。核酸適配體GVIK1在靶標細胞表面的結合位點是細胞膜蛋白或膜蛋白相關結構，其在靶標細胞表面的結合位點出現(xiàn)在病毒感染后的第5 h。臨床試驗結果表明，篩選獲得的核酸適配體GVIK1可作為高特異性分子探針用于診斷GCRV感染所致的草魚出血病。【結論】基于SELEX技術篩選獲得能特異性識別GCRVI感染宿主細胞的核酸適配體GVIK1，可作為核酸分子探針用于研發(fā)操作便捷、成本低、耗時短、準確度高的GCRV快速檢測技術，實現(xiàn)實時監(jiān)測和有效防控。

關鍵詞： 草魚呼腸孤病毒（GCRV）;指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）;核酸適配體;靶蛋白

中圖分類號： S941.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-3057-09

Abstract：【Objective】Aptamers that could recognize grass carp reovirus（GCRV） infected cells with high specificity and affinity were generated in this study， which laid the foundation for the development of GCRV detection technology with convenient operation， low cost， short time-consuming and high accuracy， and it could provide technical supports for improving the efficiency of detection and control of aquatic diseases. 【Method】Aptamer targeting GCRVⅠ infected host cells was selected via systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology（SELEX）， and further characterized by laser confocal microscopy and flow cytometry in this study. 【Result】The generated aptamer GVIK1 could specifically recognize and bind on the membrane of GCRVⅠ-infected Ctenopharyngon idellus kidney cells（CIK） cells， but not normal CIK cells or grouper nervous necrosis virus（GNNV） infected grouper spleen cells（GS）. Aptamer GVIK1 formed unique and complex stem-loop secondary structures， with Gibbs free energy（ΔG） value of -32.93 kJ/mol. Apta-mer GVIK1 showed no cytotoxicity. Aptamer GVIK1 could specifically recognize GCRV-infected CIK cells， with calculated dissociation constants（Kd） of 148.22? nmol/L， which indicated that the affinity between aptamer GVIK1 and target cells was rather strong， reaching nanomolar level. The binding site of aptamer GVIK1 on the surface of target cells was a membrane protein or membrane protein related structure， the binding site of aptamer GVIK1 appeared on the cells surface at 5 h post infection. The clinical trials results showed that the aptamer GVIK1 could serve as a highly specific molecular probe for the diagnosis of grass carp hemorrhagic disease caused by GCRV infection. 【Conclusion】Aptamer GCRVI generated by SELEX technology in this study can specifically recognize GCRVI-infected host cells. It can be used as the molecular probe to develop the rapid detection technology of GCRV with convenient operation， low cost， short time consuming and high accuracy， so as to realize real-time monitoring and effective prevention and treatments against GCRV infection.

Key words： grass carp reovirus（GCRV）; exponential enrichment technology（SELEX） ; aptamer;? target protein

Foundation item：Joint Foundation Key Support Project of National Natural Science Foundation of China（U20A 20102）;Key Research and Development Project of Guangxi（AB18221111）;Guangxi Natural Science Foundation （2019 GXNSFAA245054）

0 引言

【研究意義】草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）作為一種高致病性魚類傳染病毒，通常呈暴發(fā)式感染，即在極短時間內可導致草魚大量感染死亡（楊映等，2015;劉世旭等，2018）。由GCRV引起的草魚出血病在我國廣泛存在，嚴重制約著我國草魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展（Rao and Su，2015;Wang et al.，2016）。因此，研發(fā)出操作便捷、成本低、耗時短、準確度高的GCRV快速檢測技術，加強水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的監(jiān)測和防控管理，對有效控制草魚出血病的暴發(fā)流行具有重要意義。【前人研究進展】GCRV隸屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）水生動物呼腸孤病毒屬（Aquareovirus），是引發(fā)草魚出血病的高致病性傳染病毒，感染后1周內的死亡率可達90%～100%，給我國的草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失（李賢等，2016）。GCRV除能感染草魚外，還能感染布氏餐條（Hemicculter leuciclus）、青魚（Mylopharyngodon piceus）及麥穗魚（Pseudorasbora parva）等，且致死率極高（王方華和李安興，2006）。研發(fā)操作便捷、檢測精準的水產(chǎn)疫病快速診斷試劑盒，并科學施藥，能實現(xiàn)對水產(chǎn)疫病的有效防控（李鵬飛等，2018b，2019）。Seng等（2004）曾利用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、曾偉偉等（2013）采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）分別實現(xiàn)對GCRV的成功檢測，但這些方法存在操作繁瑣、儀器昂貴、檢測耗時長和試劑保存條件苛刻等缺陷，無法滿足對規(guī)模養(yǎng)殖現(xiàn)場進行大批量樣品快速檢測的需求，因此亟需開發(fā)新型、高效、特異性強的病毒檢測技術，用于草魚出血病的快速診斷。指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology，SELEX）是一種前沿的生物文庫篩選技術，是利用化學隨機合成的單鏈寡核苷酸文庫作為起始篩選庫，將其與靶標物質在體外孵育結合，經(jīng)反復多輪篩選，最終獲得能高特異性識別結合靶標物質的單鏈核酸分子，即核酸適配體（Ellington and Szostak，1990;Yu et al.，2021b）。核酸適配體具有易篩選獲得、成本低、易修飾及穩(wěn)定性強等優(yōu)點，作為傳統(tǒng)抗體的替代物，已廣泛應用于疾病診斷治療等生命科學領域的相關研究（Pang et al.，2018;Yu et al.，2019c，2020;Liu et al.，2020）。由于核酸適配體能高特異性和高親和性識別并結合病原或病變細胞，可作為一種新型分子探針用于構建高靈敏生物傳感器（余慶等，2020）。Duan等（2016）利用SELEX技術分別篩選獲得能高特異性識別結合致病菌沙門氏菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的核酸適配體，并基于相關核酸適配體構建了多種檢測方法，實現(xiàn)對致病菌的快速精確檢測。巫朦朦等（2019）運用SELEX技術從全長為79個核苷酸包含35個隨機堿基序列的單鏈DNA文庫中篩選獲得1條與糞腸球菌能特異性結合的適配體Apt21，可作為糞腸球菌檢測的識別元件，為建立基于適配體的新型糞腸球菌檢測方法奠定了基礎?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于GCRV對草魚養(yǎng)殖業(yè)的危害性，當前亟待建立一種操作便捷且準確度高的GCRV快速檢測方法，以確保草魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展?！緮M解決的關鍵問題】以GCRV感染的宿主細胞為靶標，綜合運用SELEX技術、磁性分離技術、激光共聚焦顯微技術及流式細胞術等，篩選出能高特異性和高親和性識別GCRV感染細胞的核酸適配體，為研發(fā)操作便捷、成本低、耗時短、準確度高的GCRV檢測技術打下基礎，同時為提高水產(chǎn)疫病檢測及防控效率提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

草魚呼腸孤病毒I型（GCRVI）、石斑魚虹彩病毒廣西株（Grouper iridovirus Guangxi strain，SGIV）、石斑魚神經(jīng)壞死病毒廣西株（Grouper nervous necrosis virus Guangxi strain，GNNV）、草魚腎臟組織細胞系（Ctenopharyngon idellus kidney cells，CIK）及石斑魚脾細胞（Grouper spleen cell，GS）均由廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室保存提供（Li et al.，2015a）;25 cm2細胞培養(yǎng)瓶、細胞96孔板、細胞12孔板、細胞6孔板購自美國Corning公司;35 mm玻底培養(yǎng)皿購自杭州欣友生物技術有限公司;鏈酶親和素標記的納米磁珠購自美國Thermo公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR純化回收試劑盒、DL50 bp Marker、DL2000 DNA Marker、pMD19-T載體及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）和LB固體培養(yǎng)基（氨芐抗性）購自北京索萊寶科技有限公司。主要儀器設備：激光共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）、流式細胞儀（FACSAria II，美國BD公司）、多功能酶標儀（美國Thermo公司）、超微量分光光度計（美國Thermo公司）、PCR儀（德國Eppendorf公司）、熒光定量PCR儀（qTOWER3G Touch，德國Analytikjena公司）及凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

1. 2 起始篩選文庫設計與合成

起始篩選文庫為隨機單鏈核酸文庫，委托生工生物工程（上海）股份有限公司制備合成。文庫中的每條單鏈核酸均為95 bp，中間隨機核酸序列為50 bp，中間序列兩端的核酸序列分別為5'-GACGCTTACT CAGGTGTGACTCG-3'和5'-CGAAGGACGCAGA GAAGTCTC-3'。5'端正向鏈引物和3'端反向鏈引物序列分別是5'-GACGCTTACTCAGGTGTGACTC G-3'和5'-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3'。

1.3 靶標細胞（GCRVI感染CIK細胞）準備

參照Xiao等（2019）、Yu等（2019d）的方法，將復蘇的CIK細胞轉入細胞培養(yǎng)瓶中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后接入10 ?L GCRVI（107 TCID50/mL），28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，移除細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，使用PBS洗滌3次，收集到的細胞即為GCRVI感染細胞（靶標細胞）。

1. 4 SELEX技術篩選流程

利用SELEX技術篩選出能高特異性識別結合靶標細胞的核酸適配體，具體操作步驟如下：取5 nmol隨機單鏈寡核苷酸文庫在92 ℃水浴鍋中變性處理8 min，然后迅速插入冰水中復性15 min，溶解于200 ?L PBS中;文庫與正常CIK細胞在冰上孵育結合40 min，收集上清液;將上清液與靶標細胞在冰上孵育結合40 min，用PBS輕輕洗滌3次以除去特異性結合不強的單鏈寡核苷酸。隨后將靶標細胞在92 ℃水浴鍋中處理5 min，1000×g離心3 min，收集上清即獲得靶標細胞上結合的單鏈寡核苷酸;以單鏈寡核苷酸為模板進行PCR擴增。所用引物為羥基熒光素（6-carboxy-fluorescein，F(xiàn)AM）修飾的正向引物（FAM-FP）和生物素（Biotin）修飾的反向引物（biotin-RP）。擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行20個循環(huán);72 ℃延伸5 min，獲得雙鏈DNA產(chǎn)物。

通過鏈霉親和素—生物素反應，對雙鏈DNA產(chǎn)物進行分離，以獲得用于下一輪SELEX篩選的單鏈DNA核酸文庫。具體操作步驟如下：將100 ?L鏈酶親和素標記的磁珠與雙鏈DNA在28 ℃下孵育10 min，使雙鏈DNA特異性結合到納米磁珠表面，然后用磁性分離器將磁珠從溶液中分離出來。移除溶液后，在磁珠中加入PBS反復洗滌3次，再加入200 ?L NaOH溶液（200 mmol/L），28 ℃孵育15 min，此時雙鏈DNA分解成單鏈DNA，生物素標記的反向單鏈DNA結合在磁珠表面，而正向單鏈DNA游離在上清液中。收集上清液，使用HCl溶液調節(jié)上清液pH，然后采用PCR純化回收試劑盒純化回收正向單鏈DNA，用于下一輪SELEX篩選。為了確保每輪獲得的單鏈核酸文庫特異性和親和力不斷提高，在隨后的SELEX篩選中會逐步增加PBS洗滌靶標細胞的次數(shù)，并逐漸減少單鏈核酸文庫與靶標物質的結合時間，以及減少靶標細胞和單鏈核酸文庫的使用數(shù)量。

1. 5 核酸適配體序列確定

以最終獲得的單鏈寡核苷酸文庫為模版，使用普通5'端正向引物（FP）和3'端反向引物（RP），經(jīng)PCR擴增為雙鏈核酸。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對核酸進行切膠回收，將其連接至pMD19-T載體并轉化DH5α感受態(tài)細胞，然后將DH5α感受態(tài)細胞均勻涂布于氨芐抗性LB培養(yǎng)基上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h，挑取單克隆進行測序，以獲得核酸適配體序列。核酸適配體委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，5'端標記FAM熒光標簽（FAM-aptamer）。核酸適配體二級結構和吉布斯自由能（ΔG）采用MFOLD進行預測分析。

1. 6 激光共聚焦技術分析核酸適配體識別結合靶標細胞特異性

將CIK細胞接入玻底培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)24 h后接入GCRVI，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用光學顯微鏡觀察靶標細胞的病變情況。FAM-aptamer（500 nmol/L）經(jīng)92 ℃恒溫水浴、冰浴復性處理后加入玻底培養(yǎng)皿中，4 ℃孵育結合20 min，用PBS輕輕洗滌，略干燥后以抗熒光淬滅劑封片，置于激光共聚焦顯微鏡下進行熒光信號觀察。對照組共3組：不接入病毒CIK細胞、SGIV感染GS細胞及GNNV感染GS細胞。

1. 7 流式細胞術定量分析核酸適配體識別結合靶標細胞特異性

FAM-aptamer（500 nmol/L）經(jīng)92 ℃恒溫水浴及冰浴復性處理后，與靶標細胞4 ℃孵育20 min;孵育結束后用PBS輕輕洗滌，混勻至400 ?L PBS中，使用流式細胞儀上機檢測。對照組共3組：不接入病毒CIK細胞、SGIV感染GS細胞及GNNV感染GS細胞，每組設3個平行。

1. 8 核酸適配體細胞毒性分析

將CIK細胞接入細胞96孔板，28 ℃培養(yǎng)24 h。試驗組將核酸適配體在細胞培養(yǎng)基中稀釋成不同濃度（500、1000和2000 nmol/L）后接入CIK細胞;對照組為不接入核酸適配體的正常CIK細胞。各組細胞經(jīng)28 ℃培養(yǎng)48 h后，分別加入20 μL CCK-8溶液，28 ℃再孵育4 h。然后在酶標儀450 nm處檢測其吸光值，以檢測各組細胞的活性。每組細胞均設3個重復。將各組樣品測得的吸光值代入以下公式，計算各組細胞存活率（Survival rate，SR）（Yu et al.，2020）：

SR（%）=OD450 nm（試驗組）/OD450 nm（對照組）×100 （1）

1. 9 核酸適配體結合靶標細胞的親和常數(shù)

FAM-aptamer經(jīng)92 ℃恒溫水浴及冰浴復性處理后，稀釋至不同濃度（0～1000 nmol/L），與靶標細胞4 ℃避光孵育20 min;孵育結束后用PBS輕輕洗滌，混勻至PBS中，使用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度。對照組為與FAM-aptamer孵育的正常CIK細胞。每組細胞均設3個重復。使用Sigmaplot計算核酸適配體的親和常數(shù)（Kd），具體計算公式如下：

Y=Bmax*X/（Kd+X）? ? ? ? ? ?（2）

式中，Bmax表示核酸適配體與靶標細胞結合的最高熒光強度;Y表示稀釋至不同濃度的核酸適配體與靶標細胞結合的熒光強度平均值;X表示核酸適配體濃度。

1. 10 核酸適配體的靶標性質分析

靶標細胞與FAM熒光標記的核酸適配體（500 nmol/L）在4 ℃下避光結合20 min后，使用胰酶對其進行消化處理2 min，然后用PBS輕輕洗滌，混勻于PBS中，使用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度;對照組為靶標細胞與FAM-aptamer（500 nmol/L）孵育結合的熒光強度。每組細胞均設3個重復。

1. 11 核酸適配體靶標分子出現(xiàn)在靶標細胞表面的時間分析

CIK細胞在細胞12孔板28 ℃培養(yǎng)24 h后接入GCRVI，再置于28 ℃細培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。通過光學顯微鏡觀察細胞病變情況，并分別在接入GCRVI后1、2、3、4、5、6和7 h時收集細胞，與FAM-aptamer （500 nmol/L）在4 ℃下避光孵育結合20 min，然后用PBS輕輕洗滌，混勻于PBS中，使用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度;對照組為正常CIK細胞與FAM-aptamer（500 nmol/L）孵育結合的熒光強度。每組細胞均設3個重復。

1. 12 核酸適配體檢測GCRVI感染組織

取體形相近的草魚（體長10～12 cm/尾，體重30～40 g/尾），空腹24 h后腹腔注射100 ?L GCRVI（107 TCID50/mL），注射24 h后采集草魚腎臟組織;以未經(jīng)處理的健康草魚（對照組1）和注射100 ?L PBS的草魚（對照組2）為對照組。各組樣品均取100 mg用PBS漂洗后切碎，重懸于400 ?L PBS，并分別稀釋為1/100（試驗組1）和1/10（試驗組2）。各組樣品均與FAM熒光標記的核酸適配體（500 nmol/L）在4 ℃下避光結合20 min，以PBS輕輕洗滌后再重懸于100 ?L PBS，置于水浴鍋中92 ℃處理3 min，5000×g離心3 min，收集上清液，采用熒光酶標儀進行檢測。每組樣品均設3個重復。

2 結果與分析

2. 1 特異性識別靶標細胞的核酸適配體

FAM熒光標記的各輪單鏈核酸文庫（500 nmol/L）與靶標細胞結合后，使用流式細胞儀對靶標細胞的熒光強度進行檢測，結果顯示，隨著篩選輪數(shù)的增加，靶標細胞表面的熒光強度逐漸增強，即單鏈核酸文庫識別結合靶標細胞的特異性逐步增強;經(jīng)過8輪篩選，第6輪篩選獲得的單鏈核酸文庫與靶標細胞孵育結合后，靶標細胞的平均熒光強度最高，即第6輪篩選獲得的單鏈核酸文庫對靶標細胞的特異性結合能力最強（圖1）。選取第6輪的單鏈核酸文庫進行克隆及測序分析，獲得核酸適配體GVIK1，其兩端的固定核苷酸序列無變化，中間50 bp的核苷酸序列為5'-TTCGGCGGATCTAACTTTGTCGTGGGAAACG GGGCGGACTTCACACTCGC-3'。FAM熒光標記的核酸適配體GVIK1（FAM-GVIK1）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2. 2 核酸適配體GVIK1二級結構和吉布斯自由能預測分析結果

采用MFOLD對核酸適配體GVIK1二級結構和吉布斯自由能進行預測分析，結果表明，核酸適配體GVIK1二級結構具有獨特復雜的莖環(huán)結構，其△G為-32.93 kJ/mol（圖2）。

2. 3 激光共聚焦技術定性分析核酸適配體GVIK1對靶標細胞的特異性識別

將FAM-GVIK1分別與靶標細胞、CIK細胞、SGIV感染GS細胞及GNNV感染GS細胞在4 ℃下孵育結合和洗滌后，利用激光共聚焦顯微鏡進行觀測，結果（圖3）表明，在靶標細胞表面出現(xiàn)明顯的FAM熒光信號，而其他對照細胞均無明顯的熒光信號，說明核酸適配體GVIK1能特異性識別結合在GCRVI感染的CIK細胞表面。

2. 4 流式細胞儀分析核酸適配體GV1K1對靶標細胞的特異性識別

將FAM-GVIK1分別與靶標細胞、CIK細胞、SGIV感染GS細胞及GNNV感染GS細胞在4 ℃下孵育結合和洗滌后，利用流式細胞儀檢測各組細胞表面的FAM熒光強度，結果（圖4）顯示，靶標細胞表面的熒光強度極顯著高于其他對照細胞表面的熒光強度，進一步說明核酸適配體GVIK1能高特異性識別結合在GCRVI感染的CIK細胞表面。

2. 5 核酸適配體GVIK1的細胞毒性分析結果

通過細胞毒性試驗進一步驗證核酸適配體GVIK1的細胞毒性，結果（圖5）表明，與正常的CIK細胞相比，CIK細胞與不同濃度（500、1000和2000 nmol/L）的核酸適配體GVIK1孵育結合后，其細胞存活率分別為97.26%、102.96%和100.05%，說明核酸適配體GVIK1無細胞毒性。

2. 6 核酸適配體GVIK1結合靶標細胞的Kd

利用流式細胞術檢測FAM-GVIK1特異性結合靶標細胞的平均熒光強度，然后代入公式（2）計算核酸適配體GVIK1結合靶標細胞的Kd。如圖6所示，核酸適配體GVIK1結合靶標細胞的Kd為148.22 nmol/L，即核酸適配體GVIK1與靶標細胞間的親和力極強，達納摩爾級別。

2. 7 核酸適配體GVIK1的靶標分子鑒定結果

靶標細胞與FAM-GVIK1（500 nmol/L）在4 ℃下進行避光結合及胰酶消化處理后，使用流式細胞術檢測靶標細胞的熒光強度。與對照組的靶標細胞相比，核酸適配體GVIK1結合靶標細胞表面的熒光強度極顯著升高，但經(jīng)胰酶消化處理后，靶標細胞表面的熒光極顯著降低（圖7），說明核酸適配體GVIK1在靶標細胞表面的結合位點是細胞膜蛋白或膜蛋白相關結構。隨后使用流式細胞儀分析核酸適配體GVIK1靶標分子在靶標細胞表面的出現(xiàn)時間，結果（圖8）顯示，F(xiàn)AM-GVIK1與靶標細胞的結合量在GCRVI感染的第5 h顯著升高，即核酸適配體GVIK1在靶標細胞表面的結合位點出現(xiàn)在病毒感染后的第5 h。

2. 8 核酸適配體GVIK1對GCRV感染草魚腎臟組織的檢測結果

FAM-GVIK1與各組草魚腎臟織樣品在4 ℃下避光結合后，使用熒光酶標儀進行檢測，結果（圖9）表明，GCRVI感染草魚腎臟組織樣品（試驗組1和試驗組2）與FAM-GVIK1孵育結合后測得的熒光強度顯著高于對照組（對照組1和對照組2）草魚腎臟組織樣品的熒光強度，說明核酸適配體GVIK1可作為高特異性分子探針用于診斷GCRV感染所致的草魚出血病。

3 討論

草魚是我國最大宗的淡水養(yǎng)殖品種，2018年的草魚年產(chǎn)量達550萬t（農業(yè)農村部漁業(yè)漁政管理局等，2019）。但在高密度養(yǎng)殖條件下，草魚的各種病害頻繁暴發(fā)，其中GCRV是造成草魚暴發(fā)性疫病的最主要病原之一，GCRV導致的草魚出血病致死率高達90% （李賢等，2016）。至今，已針對GCRV研制開發(fā)出多種檢測技術，包括基于抗體的免疫檢測、PCR及環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）等（Seng et al.，2004;Jing et al.，2013;Zhang et al.，2013），但這些方法并不適用于養(yǎng)殖現(xiàn)場開展大批量樣品的快速檢測。PCR能高靈敏度、高精確度檢測出病原感染，但由于操作繁瑣、檢測所需的PCR儀價格昂貴及試劑保存條件苛刻等原因，因此PCR主要是專業(yè)技術人員在實驗室條件下對少量樣品進行病原精確檢測。ELISA等免疫學檢測技術因具有方便、快捷等優(yōu)點而被廣泛應用，但免疫學檢測技術也存在一定局限（Li et al.，2016），包括抗體必須在低溫條件下保存，不同批次間的抗體特異性和質量具有一定差異，且與結構類似化合物易發(fā)生交叉反應而導致假陽性檢測結果。因此，研發(fā)出操作便捷、特異性強、準確度高且適用于養(yǎng)殖現(xiàn)場使用的新型快檢技術，是實現(xiàn)水產(chǎn)疫病病原快速檢測及實時診斷的重要保障。

核酸適配體是一種新型的高特異性核酸分子探針，具有特異性強、親和性高、合成成本低、易修飾及穩(wěn)定性強等優(yōu)點（Tan et al.，2013;Yu et al.，2021b），其二級結構通常具有典型的莖環(huán)結構，在氫鍵、疏水鍵、堿基堆積和范德華力等次級鍵的作用下，能自發(fā)折疊形成復雜的三級立體結構。核酸適配體可通過空間構象變化和構型互補，實現(xiàn)對靶物質的特異性識別與結合（Li et al.，2014）。目前，國內外學者已針對多種病原篩選獲得特異性的核酸適配體。其中，細菌性病原包括單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（Duan et al.，2013a）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）（Duan et al.，2013b）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）（Savory et al.，2013）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）（Zhang et al.，2013;Yu et al.，2019a）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（Moon et al.，2015）及鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）（Moon et al.，2015）等;病毒性病原包括狂犬病病毒（Rabies virus）（Liang et al.，2012）、虹彩病毒（Iridovirus）（Li et al.，2015a，2015b;Yu et al.，2020，2021a）、流感病毒（Influenza virus）（Li et al.，2016）、細小病毒（Muscovy duck parvovirus）（Lu et al.，2018）及神經(jīng)壞死癥病毒（Nervous necrosis virus）（Yu et al.，2019b;Zhou et al.，2020）等。本研究以GCRVI感染的宿主細胞為靶標，成功篩選獲得特異性分子探針——核酸適配體GVIK1。核酸適配體GVIK1長度為95 bp，其二級結構具有典型的莖環(huán)結構，△G為-32.93 kJ/mol;GVIK1能特異性識別結合GCRVI感染細胞（靶標細胞），但不識別CIK細胞、SGIV感染GS細胞及GNNV感染GS細胞。核酸適配體親和力能指示核酸適配體結合靶標分子的強度（Li et al.，2015a）。本研究結果表明，核酸適配體GVIK1結合靶標細胞的親和力達納摩爾級別，其親和常數(shù)（Kd）為148.22 nmol/L，與本課題組先前報道的其他核酸適配體親和力（Liang et al.，2012;Li et al.，2015a;Yu et al.，2019b，2020）一致。

近年來，國內外學者已利用核酸適配體研發(fā)出多種可快速、精確診斷水產(chǎn)疫病的新型檢測技術或生物傳感器（Tan et al.，2013;Duan et al.，2016;Li et al.，2016;Yu et al.，2021b），Zhou等（2017）基于核酸適配體Q3研發(fā)出Q3-ELASA，李鵬飛等（2018a）基于核酸適配體Q5研發(fā)出熒光分子探針檢測技術（Q5-AFMP）;且Q3-ELASA和Q5-AFMP在診斷石斑魚虹彩病毒病及石斑魚病毒性神經(jīng)壞死癥時具有成本低、耗時短、操作便捷、準確度高等優(yōu)點，其靈敏度與PCR相當。在本研究中，核酸適配體GVIK1能特異性識別GCRVI感染CIK細胞，但不識別正常的CIK細胞，說明GVIK1的靶標是在病毒感染宿主細胞后出現(xiàn)在細胞表面，且靶標出現(xiàn)的時間是病毒感染后第5 h。這些靶物質作為生物標志物出現(xiàn)，提示細胞處于病理或某種特定狀態(tài)下，因此核酸適配體可用于發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法無法探測的新型分子事件（Huang et al.，2011）。Yu等（2019c，2020）利用特異性識別SGIV感染細胞的核酸適配體Q5，鑒定出Q5的靶標蛋白即SGIV病毒的主要衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP），并證實SGIV病毒在侵染過程中其MCP會出現(xiàn)在病毒感染的細胞膜上，然后通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞在病毒感染細胞中轉運，而此過程依賴于動力蛋白、膽固醇、低pH及肌動蛋白絲。

4 結論

基于SELEX技術篩選獲得能特異性識別GCRVI感染宿主細胞的核酸適配體GVIK1，可作為核酸分子探針用于研發(fā)操作便捷、成本低、耗時短、準確度高的GCRV快速檢測技術，實現(xiàn)實時監(jiān)測和有效防控。

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（責任編輯 蘭宗寶）