張娟琴,陳思尹,,唐衛(wèi)紅，白娜玲,李雙喜,鄭憲清,肖 明,呂衛(wèi)光*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，農(nóng)業(yè)部上海農(nóng)業(yè)環(huán)境與耕地保育科學(xué)觀測實驗站，上海低碳農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201403；2 上海師范大學(xué)，上海 200235；3 上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103)

多環(huán)芳烴(PAHs)由兩個或兩個以上的芳環(huán)稠合而成，根據(jù)芳香環(huán)數(shù)目和組合方式的差異分為：低分子量PAHs(2—3個芳香環(huán))、高分子量PAHs(4個及以上芳香環(huán))兩類。PAHs具有誘變性、致癌性、生物累積性、不易降解等特點，先后被多國列入優(yōu)先控制污染物[1-2]。PAHs主要來源化石燃料的燃燒、生活垃圾的焚燒以及化工行業(yè)排放的廢棄物等，全世界每年約有43 000 t、230 000 t的PAHs分別排入大氣環(huán)境、水體環(huán)境，造成嚴(yán)重的污染[3-5]。微生物生長周期短、種類豐富、易于馴化培養(yǎng)，使其修復(fù)具有便于操作、修復(fù)成本低、對生態(tài)環(huán)境影響小等特點，在PAHs污染修復(fù)與治理方面，具有良好研究及應(yīng)用前景[6-7]。近幾十年來，分離所得的各類降解PAHs的微生物中，細(xì)菌的數(shù)量居于首位[8]，主要類型包括伯克氏菌屬[9]、分支桿菌屬[10]、鞘氨醇單胞菌屬[11]、假單胞菌屬[12]、紅球菌屬[13]、芽胞桿菌屬[8]等，但高分子量PAHs降解菌較少[5,14]。本試驗對污染環(huán)境中分離所得的菌株進(jìn)行篩選，分析其在PAHs液體培養(yǎng)基中的降解特性，以篩選高效的PAHs降解菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌

供試菌主要為上海金山石化廠附近的土壤中分離所得，分別編號sh0、sh1、sh2、sh3、sh4、sh5、sh6、t1、t5、B5，其中B5為上海師范大學(xué)提供,用于篩選高潛能的PAHs降解菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaMoO4·2H2O 0.001 gL、MnSO4·H2O 0.005 gL、ZnSO4·7H2O 0.005 gL、MgSO4·7 H2O 0.2 gL、CaCl20.02 gL、FeCl3·6H2O 0.05 gL、K2HPO4·3H2O 1.3 gL、KH2PO41.0 gL、NH4NO31.0 gL、CuSO4·5H2O 0.000 5 gL，固體培養(yǎng)基再加入1.5%的瓊脂粉。

選擇性培養(yǎng)基：滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基冷卻至82 ℃時加入PAHs丙酮溶液搖勻，待丙酮完全揮發(fā)后備用。

1.2 方法

1.2.1 PAHs降解菌的篩選

1.2.2 降解菌降解潛能分析

菌懸液的制備及粗酶液提取：富集培養(yǎng)后，菌懸液5 000 rmin離心6 min收集細(xì)胞，用pH 7.5，0.1 molL的磷酸鉀緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，然后重新懸浮于相同的緩沖液中制成所需濃度的菌懸液。菌懸液加入5 mm 的小玻璃珠，使菌液沒過小玻璃珠 1.0—1.2 cm在漩渦混合器上振蕩破碎 5 min后，在8 000 rmin離心機(jī)上離心20 min，上清液即為粗酶液。

脫氫酶活性測定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法測定，用分光光度計測OD485值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為三苯基甲臜(TF)的含量[15]。

鄰苯二酚2,3-雙加氧酶(C23Oase)：采用鄰苯二酚氧化比色法，粗酶液加適量鄰苯二酚溶液，置30 ℃左右溫育30 min，用分光光度計測OD375值[16-17]。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.4 菌株降解特性

降解菌株生長曲線：用適量的0.85%生理鹽水將篩選到的菌株稀釋至600 nm處光吸收值(OD600)為0.1的菌懸液，吸取1 mL菌懸液接入100 mL 液體選擇培養(yǎng)基中30 ℃、200 rmin下振蕩培養(yǎng)，定時取樣，每個平行3個重復(fù)，以O(shè)D600表示該菌株的生長量。

菌株對單一PAHs的降解：選擇培養(yǎng)基萘、蒽、芘的終質(zhì)量濃度分別為200 mgL、100 mgL、 50 mgL，每個試驗組設(shè)置3個平行，每個平行設(shè)3個重復(fù)，30 ℃、200 rmin條件下避光振蕩培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 取樣，萃取樣品中的 PAHs 后，采用高效液相色譜法測定，具體方法詳見《中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)HJ478—2009》。

菌株對混合PAHs的降解：每個三角瓶100 mL，選擇培養(yǎng)基萘、蒽、芘的質(zhì)量濃度分別為200 mgL、100 mgL、50 mgL，每株菌設(shè)3個平行，每個平行設(shè)3個重復(fù)，并設(shè)一不加菌空白對照組，30 ℃、200 rmin條件下避光振蕩培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 取樣后，分析 PAHs 的含量，方法同上。

PAHs的降解率(Degradation rate，DR)：用以表示菌株對PAHs的降解效果，其計算公式為：

(1)

其中：C0為PAHs的初始質(zhì)量濃度(mgL)，Cn為第n次采集樣品后測得的PAHs質(zhì)量濃度(mgL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAHs降解菌的篩選

以PAHs的模式化合物萘為底物進(jìn)行平板初篩，從供試菌株中篩選出5株生長較好，直徑大于15 mm的菌株，其分別為t1、t5、sh2、sh4、B5(圖1)。

2.2 降解菌降解潛能分析

生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)絕大多數(shù)在脫氫酶及氧化酶的催化下進(jìn)行，脫氫酶、雙加氧酶活性間接反映菌株降解潛力[18]。選取在萘選擇培養(yǎng)基中生長較好的菌株sh4、sh2、t1、t5、B5，測定其脫氫酶、雙加氧酶活性，分析降解潛能，對降解菌進(jìn)行復(fù)篩。菌株sh4、sh2、t1、t5、B5的脫氫酶活性[單位mg TF(L·h)]分別為49.93、35.64、11.97、15.30、41.61。菌株sh4、sh2、B5的脫氫酶活性顯著高于t1、t5(圖2)。菌株sh4、sh2、B5的雙加氧酶活性較菌株t1、t5高出1倍以上。菌株B5的雙加氧酶活性最高，較菌株sh4、sh2分別高出40.86%、87.28%(圖3)。

2.3 菌株鑒定

16S通用引物PCR擴(kuò)增得到目的DNA片段經(jīng)測序后，分別得到長度為1 359 bp(sh2)、1 372 bp(sh4)DNA序列，基因序列上傳至 NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行16S rDNA序列比對。根據(jù)比對結(jié)果，sh2屬于中華單胞菌屬(Sinomonas)，與Sinomonassp.R-NB-15(KM083584.1)序列相似性為100%；sh4屬于羅爾斯通菌屬(Ralstonia)，與Ralstoniapickettiistrain QL-140(KJ780055.1)序列相似性高達(dá)99%。B5為伯克氏菌(Burkholderia)(為上海師范大學(xué)肖明教授實驗室提供的已知菌種)。

2.4 降解菌降解特性

2.4.1 降解菌株對單一PAHs的降解特性

為了探究不同環(huán)數(shù)的PAHs對降解菌降解特性的影響，采用復(fù)篩所得的菌株sh2、sh4、B5分別對二環(huán)萘(Nap)、三環(huán)蒽(Ant)、四環(huán)芘(Pyr)進(jìn)行降解試驗，定時取樣測定菌株的生長量與相應(yīng)的PAHs的降解率。

菌株sh2、sh4、B5均能在以萘為唯一碳源的無機(jī)培養(yǎng)基中生長，分別在36—48 h進(jìn)入對數(shù)增長期，在72—84 h時細(xì)菌的生長量達(dá)到最大值。菌株B5的最大生長量較sh2、sh4，分別高出45.14%、35.76%(圖4)。在細(xì)菌生長量達(dá)到最大時，sh2、sh4、B5三株菌萘的降解率達(dá)81%以上，菌株B5 萘的降解率分別比菌株sh2、sh4高18.19%、9.09%(圖5)。

菌株sh2、sh4、B5在蒽培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前48 h生長緩慢，在84—96 h細(xì)菌的生長進(jìn)入平緩期，菌株B5的最大生長量比菌株sh2、sh4分別高出56.85%、37.04%(圖6)，蒽的降解主要發(fā)生在48—96 h內(nèi)，菌株sh2、sh4、B5對蒽的最大降解率分別為65.00%、76.12%、83.23%(圖7)。

菌株B5、sh4在芘培養(yǎng)基中生長狀況明顯好于sh2，在36—48 h進(jìn)入快速增長期，最大生長量分別較sh2高出51.50%、44.88%(圖8)，芘的降解主要發(fā)生在48—96h內(nèi)，菌株sh2、sh4、B5對芘的最大降解率分別為53.10%、68.23%、72.17%(圖9)。

隨著PAHs環(huán)數(shù)的增加，菌株B5、sh2生長速度及最大生長量均呈下降趨勢。菌株B5、在萘、蒽、芘培養(yǎng)基中的最大生長量(OD600)分別為0.576、0.540、0.433，而sh2在萘、蒽、芘培養(yǎng)基中的最大生長量(OD600)更小，分別為0.316、0.233、0.210。而多環(huán)芳烴的環(huán)數(shù)對菌株sh4的生長影響不明顯(圖4、圖6、圖8)。同樣隨著PAHs環(huán)數(shù)的增加菌株的降解能力下降，B5、sh2、sh4三個菌株對蒽、芘降解率較萘分別下降了15.56%—19.75%、20.14%—32.56%，其中菌株B5對萘、蒽、芘的降解效果最好(圖5、圖7、圖9)。

2.4.2 降解菌株對混合PAHs的降解

菌株sh4在混合PAHs中的生長趨勢與單一PAHs介質(zhì)中相似，而菌株B5、sh2優(yōu)先以萘為碳源，與萘基質(zhì)中的生長趨勢相似，菌株的增長量隨著混合多環(huán)芳烴碳源量的增加出現(xiàn)上升趨勢，但差異不顯著(圖4、圖6、圖8、圖10、圖11、圖12)。菌株B5、sh4、sh2對萘、蒽、芘的降解率分別為：82.17%—99.13%、70.76%—87.25%、52.59%—75.07%。萘的降解主要發(fā)生在72 h內(nèi)，蒽、芘隨著環(huán)數(shù)的增加降解率下降。菌株B5、sh4對芘降解率均達(dá)到70% 以上，而菌株sh2降解僅為52%(圖10、圖11、圖12)。

3 討論與結(jié)論

PAHs微生物降解一直是國內(nèi)外研究的熱點，而微生物具有生長周期短、易于馴化培養(yǎng)、種類豐富等優(yōu)點，在PAHs的生物修復(fù)、轉(zhuǎn)化及清除中具有良好的應(yīng)用前景，因此篩選高效降解菌是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[5]。本試驗通過萘選擇平板法從10株菌株中初篩出5個菌株，然后通過脫氫酶活性、雙加氧酶活性分析降解菌的降解潛能，復(fù)篩得到菌株B5、sh4、sh2，通過16S rDNA序列比對分析：sh2為中華單胞菌(Sinomonas);sh4為羅爾斯通菌(Ralstonia);B5為已知菌種伯克氏菌(Burkholderia)。

本試驗中篩選的伯克氏菌B5、羅爾斯通菌sh4、中華單胞菌sh2均以單一多環(huán)芳烴 萘、蒽、芘為唯一的碳源，隨著多環(huán)芳烴環(huán)數(shù)的增加，降解率下降，120 h內(nèi)萘、蒽、芘的降解率分別為81%—99%、65%—83%、53%—72%。黃興如等[14]報道根瘤菌SL-1對單一多環(huán)芳烴菲(100 mgL)、芘(50 mgL)5d的降解率分別為100%、74%。毛健等[19]篩選的副球菌7d內(nèi)對50 mgL芘的降解率為47.2%。相較而言，菌株B5、sh4、sh2對單一多環(huán)芳烴 萘、蒽、芘均具有較高的降解能力，而菌株B5、sh4對單一PAHs的降解能力明顯高于sh2，這可能與菌株B5、sh4具有較高的脫氫酶、雙加氧酶活性有關(guān)。陳思尹[16]研究發(fā)現(xiàn)，萘等低分子量PAHs的降解是在氧化還原酶的參與下完成。有研究表明，細(xì)菌的雙加氧酶可同時將兩個氧原子催化結(jié)合到PAHs的分子結(jié)構(gòu)中，氧與苯環(huán)結(jié)合生成C-O鍵，再經(jīng)加氫、脫水，使苯環(huán)的 C-C 鍵斷裂，從而達(dá)到降解作用[20]。除了與微生物降解有關(guān)的酶活性，細(xì)菌的生長活性也可表征PAHs的降解效果[21]。本試驗在監(jiān)測PAHs的濃度的同時，以降解菌生長活性作為參考指標(biāo)，結(jié)果也表明PAHs降解率隨著細(xì)菌生長量的增加而增加，PAHs降解趨勢與細(xì)菌增殖速度、最大生長量相關(guān)。

環(huán)境中PAHs污染物均以混合形式存在，因此研究降解菌對混合PAHs的降解效果具有現(xiàn)實意義。試驗結(jié)果表明B5、sh4、sh2均具有較高的降解能力，尤其是B5、sh4。研究發(fā)現(xiàn)菌株B5、sh2優(yōu)先以萘為碳源，混合多環(huán)芳烴中萘主要發(fā)生在72h內(nèi)，降解率為82%—99%，而蒽、芘的降解速率隨著多環(huán)芳烴環(huán)數(shù)的增加而下降，說明菌株B5、sh2優(yōu)先以低環(huán)PAHs為碳源。黃興如等[14]研究假單胞菌降解對混合PAHs萘、菲、芴、芘的降解特性，得出了相同的結(jié)論。菌株sh4對混合PAHs中萘、蒽、芘120 h的降解率分別為93.31%、79.14%、70.41%，與單一PAHs萘(90.27%)、蒽(76.12%)、芘(68.23%)降解率相比，降解趨勢相似，降解率略有上升。同時菌株sh4與單一PAHs中萘、蒽、芘的生長量及趨勢差異較小，說明菌株sh4受PAHs環(huán)數(shù)的影響較小，具有降解高環(huán)PAHs的潛能?；旌螾AHs體系中隨著碳源量的增加，3個菌株的增殖量、PAHs的降解率均略有上升，但差異不顯著，這可能與PAHs的水溶解性相關(guān)。王春明[21]研究了纖維微細(xì)菌、微桿菌等對PAHs的降解特性，結(jié)果表明多環(huán)芳烴降解與其溶解性相關(guān)。

綜上所述，菌株B5、sh4、sh2對萘、蒽、芘均具有較好的降解效果。相同條件下，菌株的降解效果與其雙加氧酶、脫氫酶活性正相關(guān)，因此菌株B5對PAHs的降解效果最佳。菌株sh4的增殖受PAHs環(huán)數(shù)的影響較小，具有降解高環(huán)PAHs的潛能。