王皎皎 胡燃燃 張丹 譙雁彬

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最為常見(jiàn)的眼部微血管并發(fā)癥，嚴(yán)重者可能會(huì)失明[1-2]。臨床研究顯示[3-4]，DR患者的視網(wǎng)膜組織中存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以誘導(dǎo)局部組織細(xì)胞凋亡和損傷。人參皂苷Rg3是從人參中分離出的一種四環(huán)三萜類(lèi)化合物單體，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[5]。有研究顯示[6]，人參皂苷Rg3具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠保護(hù)糖尿病腎臟組織。因此，本研究構(gòu)建DR大鼠模型，研究人參皂苷Rg3對(duì)病變組織PI3K-Akt/PKB通路和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器亞太參一膠囊(吉林亞泰制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030044，規(guī)格：Rg3 10 mg/粒)；鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)；SD大鼠135只，體質(zhì)量210～250 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022]；TUNEL染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；β-actin、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt)、p-Akt、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、VEGF、ICAM-1、B細(xì)胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bcl-associated X proteins，Bax)和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)蛋白及蛋白抑制劑(美國(guó)Santa Cruz公司)；VEGF、ICAM-1免疫組織化學(xué)試劑(美國(guó)Thermo公司)；細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；RT-6100酶標(biāo)分析儀(重慶唯信醫(yī)療器械公司)；濕轉(zhuǎn)儀(AB公司，美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司，Gel Doc XR+型)；電泳儀(北京君意東方電泳公司，JY300C型)。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、人參皂苷Rg3治療高劑量組(H-Rg3組)、人參皂苷Rg3治療低劑量組(L-Rg3組)，每組各15只。大鼠禁食12 h，模型組和治療組大鼠腹腔注射60 mg·kg-1鏈脲佐菌素，對(duì)照組大鼠注射等劑量的檸檬酸緩沖液。注射72 h后尾靜脈采血，檢測(cè)清晨大鼠的血糖水平，兩次檢測(cè)血糖濃度>16.7 mol·L-1，則表明糖尿病模型構(gòu)建成功。繼續(xù)觀察大鼠，進(jìn)行眼底鏡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)微血管瘤、毛細(xì)血管擴(kuò)張、眼底動(dòng)/靜脈異常，表明DR模型構(gòu)建成功。造模成功后，H-Rg3組和L-Rg3組大鼠分別腹腔注射5.0 mg·kg-1和0.5 mg·kg-1Rg3，每天1次，共28 d；模型組和對(duì)照組腹腔注射等體積劑量的生理鹽水。治療結(jié)束后將大鼠處死，分離其視網(wǎng)膜組織并經(jīng)多聚甲醛固定后石蠟保存，做成組織切片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2 視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA和LDH檢測(cè)取一定量的視網(wǎng)膜組織，勻漿，3000 r·min-1離心15 min，取上清，分別選用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測(cè)定SOD和MDA的含量，ELISA檢測(cè)LDH表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 TUNEL染色選取各組大鼠視網(wǎng)膜組織切片，按照試劑盒說(shuō)明要求，進(jìn)行TUNEL染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞，2 h內(nèi)熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。凋亡細(xì)胞比例=陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

1.2.4 HE染色將各組大鼠視網(wǎng)膜組織切片進(jìn)行HE染色，迅速滴加適量中性樹(shù)膠，蓋玻片封固，顯微鏡下觀察染色情況并分析。

1.2.5 視網(wǎng)膜組織樣本蛋白表達(dá)檢測(cè)取各組大鼠視網(wǎng)膜組織，提取組織總蛋白，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行蛋白定量。120 g·L-1SDS-PAGE電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，于4 ℃依次加入封閉液孵育2 h，一抗孵育過(guò)夜(稀釋比例均為11000)，二抗孵育2 h(稀釋比例均為 15000)。以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)分析蛋白條帶。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)取各組大鼠視網(wǎng)膜組織切片，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行ICAM-1、VEGF蛋白免疫組織化學(xué)染色，依次經(jīng)二甲苯溶液浸泡后梯度乙醇水合，然后加2滴體積分?jǐn)?shù)3% H2O2-甲醇溶液，孵育10 min，加入血清封閉20 min，用一抗、二抗依次室溫孵育30 min，DAB顯色、復(fù)染、脫水封片，顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織中蛋白表達(dá)。

1.2.7 信號(hào)通路驗(yàn)證將75只SD大鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)Y-對(duì)照組、LY-模型組、LY294002組、LY-Rg3組和LY-Rg3+LY294002組，每組各15只。LY-模型組、LY294002組、LY-Rg3組和LY-Rg3+LY294002組建立大鼠DR模型(方法同1.2.1)。造模成功后，LY294002組和LY-Rg3+LY294002組大鼠靜脈注射LY294002(0.5 mg·kg-1)，每周1次；LY-Rg3組和LY-Rg3+LY294002組大鼠腹腔注射Rg3(0.5 mg·kg-1)，每天1次，注射28 d；LY-模型組和LY-對(duì)照組接受等體積的生理鹽水腹腔注射。Western blot 檢測(cè)各組視網(wǎng)膜組織VEGF、ICAM-1、Bcl-2、Bax和cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。對(duì)于服從正態(tài)分布的連續(xù)型資料，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，若組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SNK-q檢驗(yàn)比較兩組間差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色病理分析對(duì)照組視網(wǎng)膜組織表面光滑，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)核細(xì)胞及外核細(xì)胞緊密排列；模型組內(nèi)外核細(xì)胞的單元間隙明顯縮小，細(xì)胞排列不規(guī)則，內(nèi)在限制膜存在輕微腫脹，表面不光滑；H-Rg3組和L-Rg3組細(xì)胞排列較規(guī)則，內(nèi)在限制膜表面較光滑，且隨著劑量的增加，病變明顯改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色情況(×200)

2.2 視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA和LDH檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組視網(wǎng)膜組織中SOD表達(dá)降低(P<0.05)，MDA和LDH表達(dá)均升高(均為P<0.05)；與模型組相比，H-Rg3組和L-Rg3組SOD表達(dá)均升高(均為P<0.05)，MDA和LDH表達(dá)均降低(均為P<0.05)；與L-Rg3組相比，H-Rg3組SOD表達(dá)升高(P<0.05)，MDA和LDH表達(dá)均降低(均為P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 TUNEL染色凋亡分析與對(duì)照組相比，模型組視網(wǎng)膜組織中凋亡細(xì)胞比例升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Bad、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)；與模型組相比，H-Rg3組和L-Rg3組凋亡細(xì)胞比例均降低(均為P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)，Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)均降低(均為P<0.05)；與L-Rg3組相比，H-Rg3組凋亡細(xì)胞比例降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)均降低(均為P<0.05)，見(jiàn)圖3-圖4。

2.4 VEGF和ICAM-1蛋白表達(dá)分析與對(duì)照組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF和ICAM-1蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)；與模型組相比，H-Rg3組和L-Rg3組VEGF和ICAM-1蛋白表達(dá)均降低(均為P<0.05)；與L-Rg3組相比，H-Rg3組VEGF和ICAM-1蛋白表達(dá)均降低(均為P<0.05)。見(jiàn)圖5-圖6。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激損傷分析。與對(duì)照組相比，**P<0.05；與模型組相比，##P<0.05；與L-Rg3組相比，▲P<0.05

圖3 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡(×200)

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡分析。A：TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例，B、C：Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比，**P<0.05；與模型組相比，##P<0.05；與L-Rg3組相比，▲P<0.05

2.5 PI3K/Akt/PKB信號(hào)通路分析與對(duì)照組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均降低(均為P<0.05)，Akt蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，H-Rg3組和L-Rg3組PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)，Akt蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與L-Rg3組相比，H-Rg3組PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)，Akt蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

2.6 PI3K/Akt/PKB信號(hào)通路驗(yàn)證與LY-對(duì)照組相比，LY-模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與LY-模型組相比，LY294002組VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；LY-Rg3組VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)均降低(均為P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；LY-Rg3+LY294002組VEGF、ICAM-1、Bad、cleaved-Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與L-Rg3組相比，LY-Rg3+LY294002組VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)均升高(均為P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF和ICAM-1蛋白表達(dá)(×200)

圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF(A)和ICAM-1(B)蛋白表達(dá)量。與對(duì)照組相比，**P<0.05；與模型組相比，##P<0.05；與L-Rg3組相比，▲P<0.05

圖7 各組大鼠視網(wǎng)膜組織PI3K/Akt/PKB通路蛋白表達(dá)分析。與對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01；與L-Rg3組相比，▲P<0.01

圖8 PI3K/Akt/PKB信號(hào)通路驗(yàn)證。與LY-對(duì)照組相比，**P<0.05；與LY-模型組相比，##P<0.05；與LY-Rg3組相比，▲▲P<0.05

3 討論

人參皂苷Rg3是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥人參中分離出的皂苷單體，近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)[7]，人參皂苷Rg3能夠參與機(jī)體的代謝過(guò)程，具有一定的抗氧化能力，同時(shí)能夠降低組織中微血管的密度，改善局部血管微循環(huán)。本研究中人參皂苷Rg3治療可以明顯改善DR大鼠的視網(wǎng)膜組織病變。有研究顯示[8]，高糖會(huì)引起機(jī)體活性氧大量產(chǎn)生，使組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，與非糖尿病患者相比，DR患者玻璃體內(nèi)的抗氧化能力顯著下降，提示人參皂苷Rg3對(duì)視網(wǎng)膜組織病變的保護(hù)作用可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。本研究中，人參皂苷Rg3治療后SOD表達(dá)升高，MDA和LDH表達(dá)均降低，均呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性。SOD是體內(nèi)清除氧自由基的主要生物酶，其活力的高低能夠間接反映機(jī)體消除氧自由基的能力[9]。MDA是脂質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，缺血缺氧造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)越嚴(yán)重，MDA的表達(dá)升高越明顯，其濃度水平能夠反映機(jī)體氧化損傷程度[10]。LDH是細(xì)胞損傷的標(biāo)志，只有當(dāng)細(xì)胞損傷才會(huì)由細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外[11]，提示人參皂苷Rg3能夠降低DR大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激損傷。

本研究中，人參皂苷Rg3治療后凋亡細(xì)胞比例降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)降低，且表現(xiàn)出顯著的劑量依賴(lài)性。Caspase家族和Bcl-2家族蛋白為調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要蛋白，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，抑凋亡蛋白Bcl-2顯著降低，促凋亡蛋白Bad的表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步放大凋亡信號(hào)并刺激下游Caspase-3活化，而凋亡信號(hào)一旦激活Caspase-3，細(xì)胞凋亡將進(jìn)入不可逆狀態(tài)[12]。唐俊等[13]研究表明，氧化應(yīng)激與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，人參皂苷Rg3可以抑制糖尿病腎病大鼠的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎組織免受損傷，與本研究結(jié)果基本相符，提示人參皂苷Rg3可能通過(guò)降低DR大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3治療可以降低DR大鼠視網(wǎng)膜組織中過(guò)高的VEGF和ICAM-1蛋白，均呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，VEGF能夠增強(qiáng)DR患者視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達(dá)，加強(qiáng)白細(xì)胞在視網(wǎng)膜血管的黏附作用，破壞內(nèi)皮細(xì)胞間的連接，引起血-視網(wǎng)膜損傷，并且能夠增加血管的通透性，導(dǎo)致纖維蛋白的沉積，進(jìn)一步促進(jìn)血管新生，提示人參皂苷Rg3可能通過(guò)抑制VEGF和ICAM-1蛋白表達(dá)，減輕DR大鼠視網(wǎng)膜組織損傷。PI3-K/Akt/PKB信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞途徑[15]，通過(guò)Akt的活化，促進(jìn)下游mTOR的表達(dá)，激活細(xì)胞的能量代謝途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)能夠抑制p53蛋白的表達(dá)及Bad蛋白活化，抑制細(xì)胞凋亡[16]。本研究中，人參皂苷Rg3治療后大鼠視網(wǎng)膜組織中PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高，阻斷PI3K/Akt/PKB信號(hào)通路后，VEGF和ICAM-1蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡蛋白Bad和cleaved-Caspase-3的表達(dá)也顯著升高，提示人參皂苷Rg3能夠通過(guò)激活視網(wǎng)膜組織PI3K/Akt/PKB信號(hào)通路，抑制VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)視網(wǎng)膜組織。

綜上所述，人參皂苷Rg3能夠通過(guò)降低糖尿病視網(wǎng)膜組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活PI3K/Akt/PKB信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡和VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)，改善DR大鼠的視網(wǎng)膜組織。