余勝，錢海華

1 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，合肥230000；2 江蘇省中醫(yī)院

直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。近年來，我國直腸癌的發(fā)病率有逐年上升趨勢。惡性腫瘤是由腫瘤細胞無限增殖引起的，是細胞凋亡受到抑制的結果，因而細胞凋亡抑制被認為是惡性腫瘤形成的一個重要機制。已有研究證實，直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡異常密切相關[1]。14-3-3蛋白家族是真核生物細胞中普遍存在的一類高度保守的調(diào)節(jié)性蛋白家族，幾乎參與生命體所有的生理過程。14-3-3 zeta蛋白是14-3-3蛋白家族成員之一，能夠通過抑制細胞色素酶C釋放來抑制半胱天冬酶和凋亡復合體活化，進而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。14-3-3 zeta蛋白還能靶向于線粒體的核凋亡結構，通過干預線粒體核前凋亡蛋白，發(fā)揮抗細胞凋亡作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 zeta蛋白在胃癌、膠質(zhì)母細胞瘤等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3，4]。Bcl-2家族蛋白是在細胞凋亡過程中起關鍵性作用的一類蛋白質(zhì)。p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子(PUMA)蛋白是新發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族蛋白成員，具有強大的促細胞凋亡作用。PUMA蛋白可通過依賴p53途徑或非依賴p53途徑促進細胞凋亡，其低表達或表達缺失能夠促進胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。目前，14-3-3 zeta、PUMA蛋白與直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關系尚不明確。為此，本研究觀察了直腸癌組織14-3-3 zeta、PUMA蛋白表達變化，并進一步探討其臨床意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年6月～2017年5月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收治的原發(fā)性直腸癌患者80例。所有患者經(jīng)術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合原發(fā)性直腸癌診斷；②初診；③接受直腸癌切除手術；④術前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料完整。排除標準：①轉移性直腸癌者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能不全者；④術前接受其他抗腫瘤治療者；⑤臨床病理資料不完整者。其中，男43例、女37例，年齡38～75歲(≤60歲52例、>60歲28例)；腫瘤直徑：≤5 cm 50例，>5 cm 30例；病理類型：腺癌62例，黏液腺癌18例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期47例，Ⅲ、Ⅳ期33例；組織分化程度：高中分化49例，低未分化31例；浸潤深度：侵及漿膜層32例，未侵及漿膜層48例；有淋巴結轉移54例，無淋巴結轉移26例。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 14-3-3 zeta、PUMA蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取手術切除的直腸癌組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm，經(jīng)組織病理檢查證實為正常直腸組織)，中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，4 μm厚連續(xù)切片。將切片置于60 ℃烘箱烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，EDTA抗原修復液加熱抗原修復，3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。5% BSA室溫封閉30 min，分別加入14-3-3 zeta、PUMA一抗(稀釋比均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶4 000)，室溫孵育60 min，DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化，自來水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。

采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨立閱片，意見不一致時需協(xié)商討論并取得一致意見。14-3-3 zeta蛋白陽性染色定位于細胞質(zhì)，PUMA蛋白陽性染色定位于線粒體外膜，均呈淺黃色至棕褐色顆粒狀[5]。采用半定量積分法評估染色強度和陽性細胞比例。染色強度評分標準：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張切片隨機選取5個200倍視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞比例。陽性細胞比例評分標準：無陽性細胞為0分，≤10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。以染色強度和陽性細胞比例綜合評價，二者評分乘積≥3為14-3-3 zeta或PUMA蛋白陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或精確概率檢驗。相關性分析采用Spearman秩相關分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 直腸癌組織與癌旁正常組織14-3-3 zeta、PUMA蛋白表達比較 直腸癌組織與癌旁正常組織14-3-3 zeta蛋白陽性表達率分別為76.25%(61/80)、22.50%(18/80)，PUMA蛋白陽性表達率分別為31.25%(25/80)、65.00%(52/80)。直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織，PUMA蛋白陽性表達率低于癌旁正常組織(χ2分別為46.231、18.251，P均<0.05)。

2.2 直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白陽性表達與PUMA蛋白陽性表達的關系 直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白陽性表達者中，PUMA蛋白陽性表達17例、陰性表達44例；直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白陰性表達者中，PUMA蛋白陽性表達8例、陰性表達11例。Spearman秩相關分析顯示，直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白表達與PUMA蛋白表達無明顯相關性(r=-0.131，P>0.05)。

2.3 直腸癌組織14-3-3 zeta、PUMA蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

3 討論

直腸癌是發(fā)生于齒狀線至直腸與乙狀結腸交界處的惡性腫瘤，其發(fā)病多在40歲以后，以男性多見[6]。盡管手術、靶向治療及放化療已在直腸癌的治療中取得了滿意療效，但患者5年總體生存率仍無法令人滿意[7]。目前，直腸癌的發(fā)病機制尚不完全清楚。有研究認為，從正常直腸上皮細胞到直腸癌細胞的演變是多基因參與、多步驟發(fā)展的結果，而細胞凋亡異常在其發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色[8]。因此，深入研究與細胞凋亡相關的蛋白對揭示直腸癌發(fā)病的分子機制具有重要意義。

14-3-3蛋白家族是真核生物細胞中普遍存在的一類高度保守的調(diào)節(jié)性蛋白家族，幾乎參與生命體所有的生理過程，如細胞周期調(diào)控、細胞信號轉導、細胞凋亡等，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中亦具有重要作用。14-3-3 zeta蛋白是該蛋白家族中的重要成員，通常以同源或異源二聚體形式存在[9]。細胞凋亡抑制和黏附力喪失是腫瘤形成過程中重要的生物學改變。14-3-3 zeta蛋白作為信號轉導的中心環(huán)節(jié)，能夠促進多種腫瘤細胞的增殖、黏附并抑制其凋亡。有研究報道，肝細胞癌組織14-3-3 zeta蛋白表達明顯高于癌旁正常組織，且其表達與腫瘤組織學分級和血管浸潤程度有關[10]。14-3-3 zeta蛋白與人表皮生長因子受體共同作用，能夠促進乳腺癌的轉移和復發(fā)[11]。Bcl-2家族蛋白是在細胞凋亡過程中起關鍵性作用的一類蛋白質(zhì)。PUMA蛋白是新發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族蛋白成員，可通過依賴p53途徑或非依賴p53途徑促進細胞凋亡。在缺氧誘導的腫瘤模型中，PUMA蛋白丟失能夠引起染色體的不穩(wěn)定，提高腫瘤的發(fā)生概率[12,13]。已知在超過50%的人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)p53基因突變或缺失，p53基因突變或缺失后失去誘導下游凋亡基因PUMA表達的功能，從而喪失了抑制腫瘤的作用[14]。在口腔鱗癌細胞中，上調(diào)PUMA蛋白表達可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲，并促進其凋亡[15，16]。有研究還發(fā)現(xiàn)，14-3-3 zeta蛋白能夠結合Bcl-2家族蛋白靶向于線粒體的核凋亡結構，通過干預線粒體核前凋亡蛋白發(fā)揮抗細胞凋亡作用[17,18]。由此推測，14-3-3 zeta、PUMA蛋白可能協(xié)同促進多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但二者與直腸癌的關系鮮見報道。

表1 直腸癌組織14-3-3 zeta、PUMA蛋白表達與患者臨床病理特征的關系(例)

本研究結果顯示，直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織，PUMA蛋白陽性表達率低于癌旁正常組織，提示在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中14-3-3 zeta蛋白具有促癌作用、PUMA蛋白具有抑癌作用。本研究直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白表達與組織分化程度有關，而與性別、年齡、腫瘤直徑、病理類型、臨床分期、浸潤深度、淋巴結轉移無關；直腸癌組織PUMA蛋白表達與腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移、組織分化程度有關，而與性別、年齡、病理類型、浸潤深度無關。提示14-3-3 zeta、PUMA蛋白表達與直腸癌的惡性進展有關。Spearman秩相關分析顯示，直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白表達與PUMA蛋白表達無明顯相關性，表明在直腸癌中14-3-3 zeta、PUMA蛋白抗細胞凋亡作用可能是通過不同通路引起的，但其具體通路還不清楚，尚需進一步研究。

綜上所述，直腸癌組織14-3-3 zeta蛋白高表達、PUMA蛋白低表達，二者表達變化能夠促進直腸癌惡性進展。