黃萍， 高紅梅， 陳云， 孫龍飛

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 中牟 451450； 2.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002)

低溫脅迫直接影響著草坪的質(zhì)量、綠期長短及越冬率，成為制約中國北方草坪業(yè)發(fā)展的主要因子之一[1]。若能開發(fā)當?shù)噩F(xiàn)有的野生資源，篩選出優(yōu)良的抗寒草坪草種質(zhì)資源，不僅有利于推動北方地區(qū)草坪業(yè)發(fā)展，而且有助于緩解當前中國草坪草種過于依賴進口的現(xiàn)狀。

阿拉伯婆婆納為玄參科婆婆納屬的一年生或越年生草本植物，在中國華北、西北、中南、西南等地區(qū)均有分布，常集群生長、成片分布，天然低矮匍匐，具有草坪草的諸多性狀且花色為藍色，具有較高的觀賞價值和較強的花色優(yōu)勢。此外，阿拉伯婆婆納越冬性強，冬季不存在枯黃期，最冷月只是葉色有些發(fā)紅，返青也早于常見的冷季型草坪植物紅花酢漿草(OxaliscorymbosaDC.)、白三葉(Trifoliumrepens)、早熟禾(PoaannuaL.)，早春2月即開始開花，3月初為盛花期，綠期、花期優(yōu)勢均非常明顯[2]，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ挠^賞性冷季型草坪草資源。但是，目前只有楊文權(quán)等[3]對其草坪用性狀進行了初步研究，提出阿拉伯婆婆納具有綠期長、蓋度大、人工移栽成活率高、水平生長速度快等坪用草的優(yōu)點；張慶良等[4]研究了其園林應用，嘗試將阿拉伯婆婆納引入冬春季花壇而取得良好效果。而關(guān)于阿拉伯婆婆納抗寒生理特性的研究尚未見報道。

白三葉為豆科三葉草屬多年生冷季型草坪草，具有較強的抗旱、抗寒、耐鹽堿等特點[5]，現(xiàn)已廣泛用于中國北方地區(qū)草坪綠化工程中[6]。因野生白三葉和阿拉伯婆婆納具有相似的生活型和物候期，且已成功引種栽培并大面積推廣，故研究了2種植物自然降溫過程中生理反應方面對低溫脅迫響應的不同，以揭示阿拉伯婆婆納適應低溫脅迫的生理機制，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與樣地概況

試驗材料為阿拉伯婆婆納和野生白三葉，采于鄭州市中牟縣河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院園藝試驗基地內(nèi)。采樣地屬暖溫帶大陸性季風氣候，年均氣溫14.5 ℃，7月份最熱，平均氣溫26.9 ℃；12月到1月為冬季，1月份最冷，平均氣溫0.3 ℃；極端最低氣溫-13.8 ℃，極端最高氣溫44.2 ℃；年平均降雨量632 mm，無霜期220 d；土壤類型為潮土，肥力中等。

1.2 越冬率及返青情況觀測

越冬率測定方法：用20 cm×20 cm鐵絲樣方隨機測定2種植物入冬前及返青后的覆蓋度，后者與前者的比值即為越冬率。返青期參照張躍進等[7]的標準，結(jié)合2種植物的實際越冬情況，以80%的植株變綠為準。

1.3 取樣與生理指標測定

從連續(xù)5 d平均溫度低于5 ℃開始，到葉片出現(xiàn)凍害癥狀為止，每隔10 d取樣一次，具體時間分別為2018-12-14,2018-12-24,2019-01-03，每次在13:00―14:00取樣。每次取樣記錄前3 d日最高和最低氣溫，計算出前3 d的平均最高和最低氣溫。

取樣時選取2種植物生長比較一致的3塊不同地段，即3個重復。每次取樣均選取植株中部大小一致、無病蟲害的功能葉片，以盡量保證試驗材料生理特性的一致性。取完樣后，放入液氮罐迅速冷凍，回實驗室后放至-80 ℃冰箱保存，用于生理指標的測定。

測定指標包括葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性、游離脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量。SOD活性采用氮藍四唑(NBT)光化還原法測定，以抑制NBT光化還原50%為一個酶活單位。Pro含量采用茚三酮溶液顯色法測定，MDA含量用硫代巴比妥酸(TBA)反應法測定[8]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2007制作圖表，用單因素方差分析和Duncan法多重比較對同一植物不同時間以及同一時間不同植物間生理指標的差異進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣期間采樣地氣溫變化

取樣期間采樣地氣溫變化見表1。由表1可以看出，在2018-12-14―2019 -01-03取樣期間，日最低氣溫及前3 d平均最高氣溫持續(xù)下降明顯，取樣當日平均溫度均低于1 ℃，2019-01-03第3次取樣時，前3 d平均最高氣溫、前3 d平均最低氣溫及當日最低氣溫均比上一次取樣時顯著下降。

2.2 2種植物越冬覆蓋度、越冬率及返青期比較

如表2所示，越冬前，2種植物的覆蓋度差異不顯著，越冬后阿拉伯婆婆納的覆蓋度及越冬率均極顯著高于白三葉(P<0.01)，說明阿拉伯婆婆納受凍害較輕，越冬性好。以80%的植株變綠為標準，阿拉伯婆婆納2019年2月初已返青，早于白三葉1個多月，而且在2019年2月初已開始現(xiàn)花。

表1 取樣期間試驗地氣溫變化Table 1 Temperature variation in experimental field during sampling ℃

表2 2種植物越冬覆蓋度、越冬率及返青期比較Table 2 Comparison of winter coverage,overwinter rate and regreening stag of two plants

注:**表示在0.01水平上差異顯著。

Note: **indicates the significant difference at 0.01 level.

2.3 自然降溫對2種植物葉片中SOD活性的影響

在冬季自然降溫過程中，阿拉伯婆婆納和白三葉SOD活性的總體變化均呈下降趨勢(圖1)。阿拉伯婆婆納的SOD活性每次取樣測定時均高于白三葉，在2018-12-24第2次測定時，兩者之間的差異達到了顯著水平(P<0.05)，其他2次測定時2種植物SOD活性差異不顯著。同一植物不同測定時間SOD活性的差異顯著性檢驗結(jié)果表明，從2018-12-14到2018-12-24，阿拉伯婆婆納和白三葉的SOD活性均存在顯著性下降(P<0.05)，阿拉伯婆婆納的降幅為13.1%，白三葉的降幅為17.3%；從2018-12-24到2019-01-03，2種植物的SOD活性仍有下降，但差異不顯著(P>0.05)。

2.4 自然降溫對2種植物葉片中脯氨酸含量的影響

如圖2所示，在冬季自然降溫過程中，2種植物脯氨酸含量的總體變化趨勢不太一致。白三葉的脯氨酸呈緩慢上升趨勢，第2次測定與第1次測定相比幾乎沒有變化，增幅僅為2.5%，到第3次測定時才有明顯上升，3次不同測定時間之間脯氨酸含量差異不顯著；阿拉伯婆婆納葉片中的脯氨酸含量從第1次測定到第2次測定時顯著上升(P<0.05)，增幅達27.5%，到第3次測定時脯氨酸含量變化不明顯，略有下降，但仍然顯著高于第1次測定值。冬季3次不同測定時間，阿拉伯婆婆納葉片的脯氨酸含量均高于白三葉，在2018-12-24第2次測定時，二者脯氨酸含量差異較大，接近顯著水平(P=0.07)，另外2次測定時差異不顯著。

注：同一曲線標有不同小寫字母表示不同取樣時間在0.05水平上差異顯著；*表示同一取樣時間2種植物間差異顯著(P<0.05)，未標者表示差異不顯著。下同。

2.5 自然降溫對2種植物葉片中丙二醛含量的影響

在冬季自然降溫過程中，阿拉伯婆婆納和白三葉葉片MDA含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢(圖3)，即從2018-12-14到2018-12-24，MDA含量均有小幅上升，阿拉伯婆婆納的增幅為12.5%，白三葉的增幅為29.7%；從2018-12-24到2019-01-03，兩者MDA含量均有微幅下降，但變化不明顯。第3次取樣測定時3個生理指標的變化均不明顯，這可能與第3次取樣時日平均氣溫降幅減小有關(guān)。阿拉伯婆婆納的MDA含量在3次取樣測定時，始終低于白三葉，但二者之間的差異不顯著。同一植物不同測定時間MDA含量差異顯著性檢驗結(jié)果表明，2種植物的3次測定結(jié)果之間均不存在顯著性差異(P>0.05)。

圖2 自然降溫過程中2種植物葉片中Pro含量的變化

圖3 自然降溫過程中2種植物葉片中MDA含量的變化

3 結(jié)論與討論

植物抗寒性與體內(nèi)保護酶活性密切相關(guān)，保護酶活性高，說明植物對環(huán)境反應快，抗氧化能力強，抗寒性也強[9]。SOD是保護酶系統(tǒng)的核心成員，在植物的抗寒鍛煉過程中起著重要的保護作用。本研究中，3次取樣測定時，阿拉伯婆婆納葉片的SOD活性始終高于白三葉，在第2次取樣測定時，2種植物SOD活性的差異達到顯著水平，表明阿拉伯婆婆納活性氧清除能力強于白三葉，能有效保護細胞膜系統(tǒng)免受低溫傷害。冬季自然降溫過程中，2種植物葉片中SOD活性的總體變化均呈下降趨勢，但耐寒力強的阿拉伯婆婆納SOD活性降幅小于耐寒力稍弱的白三葉。這與王榕楷等[10]對3種草坪草的耐寒性與超氧化物歧化酶作用關(guān)系的研究結(jié)果一致，但與何麗斯等[11]對茉莉耐寒能力研究的結(jié)果不太一致。茉莉葉片SOD活性在自然降溫過程中呈先升后降趨勢，而本研究中2種植物SOD活性一直呈下降趨勢。結(jié)果不一致的原因可能是因為本試驗的取樣時間是在最冷月，氣溫已降至全年最低點，第2次取樣時日最低氣溫已達到-6 ℃，第3次取樣時日最低氣溫已達到-8 ℃，此時低溫脅迫強度比較大，SOD本身可能也受到一定程度的損害，因而活性一直呈下降趨勢。

植物體內(nèi)游離脯氨酸作為細胞質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在低溫脅迫下可以誘導合成，以增加細胞液濃度，降低細胞液冰點，防止細胞質(zhì)凝固和過度失水，保護細胞免受低溫傷害[12]。劉南清等[13]對假儉草葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量與低溫傷害關(guān)系的研究表明，脯氨酸是假儉草細胞內(nèi)與抗寒性相關(guān)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，假儉草葉片內(nèi)的脯氨酸可以作為假儉草耐寒性評價的重要指標。但也有研究表明，逆境下脯氨酸的積累是傷害反應，與抗性無關(guān)[14]。本研究中，阿拉伯婆婆納葉片的脯氨酸含量在每次取樣測定時均高于白三葉，且阿拉伯婆婆納脯氨酸含量在第2次取樣測定時已顯著上升，而白三葉第3次測定時才有明顯上升。結(jié)合越冬率觀測，以及其他生理指標反映的結(jié)果，本試驗中脯氨酸含量應為抗性指標，說明遭受低溫脅迫時，阿拉伯婆婆納比白三葉更能快速反應，通過自身調(diào)節(jié)增加脯氨酸的積累，維持較強的滲透調(diào)節(jié)作用，以提高其抗寒能力。

MDA是膜脂過氧化作用的終產(chǎn)物，其含量高低常用來衡量植物在逆境脅迫中受活性氧傷害的程度。低溫逆境下，MDA積累越多，膜脂過氧化程度越高，說明膜受傷害越嚴重，植物抗寒性越弱[15]。本研究結(jié)果顯示，阿拉伯婆婆納和白三葉葉片MDA含量從第1次取樣測定到第2次取樣測定時均有上升，但阿拉伯婆婆納的增幅明顯小于白三葉，而且3次測定時，阿拉伯婆婆納葉片MDA含量始終小于白三葉，說明阿拉伯婆婆納膜脂過氧化程度相對較輕，受低溫傷害的程度小于白三葉。

綜上所述，在冬季自然降溫過程中，阿拉伯婆婆納SOD誘導合成能力較強，游離脯氨酸快速積累，MDA含量小幅上升。3項生理指標表現(xiàn)出較為一致的結(jié)果，即阿拉伯婆婆更能快速反應，通過自身生理調(diào)節(jié)以適應低溫脅迫。2種植物越冬及返青情況觀測結(jié)果也表明，阿拉伯婆婆納越冬率極顯著高于白三葉，最冷月凍傷葉片明顯少于白三葉，且早春返青早于白三葉35 d，自然越冬表現(xiàn)與生理指標反映的結(jié)果一致，均表明阿拉伯婆婆納對低溫的耐受性比白三葉更強。因此，可以考慮將阿拉伯婆婆納作為冷季型草坪草在中國華北、西北地區(qū)引種栽培，以彌補該地區(qū)當前草坪草種多存在冬季枯黃期較長、無綠可賞的不足。