郭東艷 范妤 程江雪 張小飛 史亞軍 鄒俊波

1．陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽712046

2．陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽712046

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)也被稱為原發(fā)性卵巢儲(chǔ)備功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)，是指 40歲前的女性出現(xiàn)以閉經(jīng)、不孕、血清雌激素水平低下、促性腺激素水平升高等卵巢功能衰竭為特征的疾病，是婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的常見病。低雌激素狀態(tài)可繼發(fā)骨質(zhì)疏松、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病等疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。目前西醫(yī)主要使用激素替代療法，長期應(yīng)用雌激素易產(chǎn)生高血凝狀態(tài)、高血壓、水腫等副反應(yīng)，且乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病危險(xiǎn)升高，嚴(yán)重危害健康［1］。

近年來，作用溫和的植物雌激素(phytoestrogen，PE)引起人們廣泛關(guān)注。植物雌激素是指從天然植物中提取，其結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素相似的一類化合物，當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)，能夠通過與雌激素受體結(jié)合模擬雌激素的理化作用［2］。湖北海棠是薔薇科蘋果屬(malusmill．)湖北海棠［malushupehensis(pamp．)rehd］的干燥葉，主要成分為黃酮類及茶多酚。有研究［3］表明其黃酮類成分具有植物雌激素活性，對(duì)去勢大鼠所致的骨質(zhì)疏松有良好的治療作用，但具體作用機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以灌胃雷公藤多苷片復(fù)制成年大鼠卵巢早衰模型，研究湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠的卵巢功能及骨代謝的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為湖北海棠的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡成年SD雌性大鼠48只，體質(zhì)量(250±20)g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào) SYXK－R(陜)2012－003。室溫，不禁食不禁水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑:雷公藤多苷片購自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司(批號(hào)20131102);戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂)購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司(批號(hào)17OA);兔抗鼠ERα多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號(hào) bs－0725R);羊抗兔 IgG SABC免疫組化試劑盒(批號(hào)12I26C)購自博士德生物工程研究所;碘［125Ⅰ］雌二醇(E2)、［125Ⅰ］孕酮(P)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)放射免疫分析藥盒，均購買于北京北方生物技術(shù)研究所(批號(hào)均為20130920);大鼠堿性磷酸酶ELISA試劑盒、大鼠骨堿性磷酸酶 ELISA試劑盒、大鼠1，25(OH)2D3ELISA試劑盒，均購自上海酶科生物科技有限公司;過氧化物歧化酶(SOD)(批號(hào)20140726)、丙二醛(MDA)(批號(hào)20140721)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;HPD100型大孔樹脂購自河北滄州寶恩化工有限公司。

1.1.3 儀器:北京東華原超高速低溫抽出機(jī);德國艾本德Centrifuge 5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī);多功能成像系統(tǒng);北京伯樂BIO－RAD Model680酶標(biāo)儀;德國徠卡Leica RM2235切片機(jī);德國蔡司ZEISS顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 湖北海棠總黃酮的制備:湖北海棠總黃酮提取物按照參考文獻(xiàn)［4～6］制備提取純化并測定含量。五種黃酮類成分的含量分別為金絲桃苷0.78%、槲皮苷5.3%、根皮苷19.7%、槲皮素1.18%、根皮素7.78%。

1.2.2 卵巢早衰模型建立:參考相關(guān)文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果［7－8］，將48只 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，按照體重和隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、模型組、戊酸雌二醇組及湖北海棠總黃酮高、中、低劑量組，每組8只。除空白組外，其余各組每日灌胃雷公藤多苷片(75 mg/kg)，連續(xù)造模14 d，復(fù)制卵巢早衰模型。每日定時(shí)做陰道涂片，觀察動(dòng)情周期變化。

1.2.3 分組與給藥方法:從第15天開始，模型組灌胃生理鹽水(2 mL/kg);戊酸雌二醇組灌胃戊酸雌二醇(1 mg/kg);湖北海棠總黃酮高、中、低劑量組分別給予灌胃湖北海棠總黃酮(160、80、40 mg/kg)。每日1次，連續(xù)給藥21 d。

1.2.4 取材:末次給藥后禁食不禁水，16 h后通過水合氯醛麻醉，行腹主動(dòng)脈采血，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆?。通過常規(guī)無菌操作法取大鼠雙側(cè)卵巢、子宮，稱重;取材二分之一置于－80℃保存?zhèn)溆茫Ｓ嘀糜?%甲醛溶液中固定。

1.2.5 觀察大鼠動(dòng)情周期:每天早晨進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，HE染色后在光鏡下觀察動(dòng)情周期變化，以判斷模型復(fù)制是否成功。

1.2.6 卵巢、子宮臟器指數(shù)測定:取大鼠雙側(cè)卵巢、子宮，去除周圍脂肪組織，用電子天平精密稱重，計(jì)算臟器指數(shù)［臟器指數(shù)(%)=臟器濕重(g)/體質(zhì)量(g)×100%］，結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示。

1.2.7 血清性激素水平檢測:采用放射免疫法測定血清中雌激素 (E2)、孕酮(P)、黃體生成素 (LH)和卵泡刺激素 (FSH)的水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.8 卵巢、子宮形態(tài)學(xué)觀察:卵巢、子宮組織在4%甲醛溶液中固定48 h后，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片后，在光鏡下觀察卵巢及子宮內(nèi)膜的組織學(xué)變化。

1.2.9 血清堿性磷酸酶、骨堿性磷酸酶、1，25(OH)2D3的檢測:通過ELISA法檢測血清中ALP、BALP、1，25(OH)2D3含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.10 血清SOD活力、MDA含量的檢測:通過TAB法檢測血清中MDA的含量、WST－1法檢測血清SOD活力，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.11 SABC法檢測卵巢組織中雌激素受體ERα蛋白的表達(dá):一抗為兔抗鼠ERα多克隆抗體，二抗用生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知強(qiáng)陽性石蠟切片作陽性對(duì)照。結(jié)果使用 Image－pro plus7.1軟件測定圖片平均光密度(AOD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示各組動(dòng)物的指標(biāo)數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠動(dòng)情周期的影響

空白組雌性大鼠動(dòng)情周期穩(wěn)定，每個(gè)周期約3～4 d，分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。造模2周，除空白組外，各組大鼠動(dòng)情周期紊亂并延長，陰道脫落細(xì)胞失去各期典型的形態(tài)學(xué)特征，表明給予雷公藤多苷片后，大鼠卵巢功能被抑制，激素的周期性分泌被干擾。給予湖北海棠總黃酮灌胃治療3周后，各組大鼠動(dòng)情周期逐漸趨于穩(wěn)定，時(shí)間縮短，陰道脫落細(xì)胞回復(fù)正常周期性變化，且動(dòng)情期角化細(xì)胞數(shù)量顯著增多。見圖1。

圖1 大鼠動(dòng)情周期各時(shí)項(xiàng)陰道脫落細(xì)胞形態(tài)變化(HE，×100)Fig．1 Morphological changes of vaginal exfoliated cells at different periods of estrous cycle in rats(HE，×100)

2.2 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)的影響

雷公藤多苷片造模后，模型組大鼠子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)、脾指數(shù)均較空白組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮高劑量組大鼠子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)、脾指數(shù)均較模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。模型組大鼠胸腺指數(shù)較空白組升高，戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮高劑量組胸腺指數(shù)較模型組降低，具有顯著性差異(P＜0.01)。腎上腺指數(shù)各組間差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠血清性激素水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清E2、P含量降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);戊酸雌二醇組及湖北海棠總黃酮高、中劑量組均能升高卵巢早衰大鼠血清E2、P水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。模型組大鼠血清LH較空白組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，戊酸雌二醇組及湖北海棠總黃酮高、中劑量組均能降低大鼠血清LH水平，與模型對(duì)照組比較有極顯著性差異(P＜0.01)。各組血清FSH含量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表 2。

表1湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠臟器指數(shù)的影響(珋x±s，n=8)Table 1Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on organ index in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

表2湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠血清性激素水平的影響(珋x±s，n=8)Table 2Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on serum sex hormone levels in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

2.4 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)影響

空白組大鼠子宮內(nèi)膜較厚，約占子宮壁2/3，上皮以高柱狀分泌細(xì)胞為主，固有層可見較多子宮腺，且腺腔大，腔內(nèi)可見分泌物，基質(zhì)疏松，血管豐富。模型組子宮內(nèi)膜薄，固有層子宮腺少，腺腔小，螺旋動(dòng)脈稀疏。湖北海棠總黃酮不同劑量組與模型組比較，子宮內(nèi)膜增厚明顯，上皮以高柱狀分泌細(xì)胞為主，固有層腺體增多，腺腔增大，腔內(nèi)可見分泌物，基質(zhì)疏松，多見螺旋動(dòng)脈及豐富的毛細(xì)血管。見圖2。

2.5 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢組織形態(tài)影響

圖2 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)的影響(HE，×200)Fig．2 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on endometrium morphology in rats with premature ovarian failure(HE，×200)

空白組大鼠卵巢皮質(zhì)可見各級(jí)卵泡相間分布，模型組與空白組比較，卵巢皮質(zhì)中卵泡數(shù)量明顯減少，尤其生長卵泡(初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡)所占比例明顯下降，且閉鎖卵泡增加。雌激素組生長卵泡數(shù)量明顯多于模型組，且黃體數(shù)量接近空白組。湖北海棠各劑量組與模型組相比，生長卵泡與黃體數(shù)量均顯著增多，黃體多見。見圖3。

圖3 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢組織形態(tài)的影響(HE，×200)Fig．3 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on the morphology of ovarian tissue in rats with premature ovarian failure(HE，×200)

2.6 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠血清堿性磷酸酶、骨堿性磷酸酶、1，25(OH)2D3含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清ALP、BALP活力顯著增加，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。戊酸雌二醇組及湖北海棠高、中劑量給藥組大鼠血清ALP、BALP活力均顯著下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與空白組比較，模型組大鼠血清1，25(OH)2D3含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。戊酸雌二醇組及湖北海棠不同劑量給藥組大鼠血清1，25(OH)2D3含量均顯著升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05;P＜0.01)。見表 3。

表3 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠血清ALP、BALP及1，25(OH)2D3含量的影響(珋x±s，n=8)Table 3 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on serum ALP activity，BALP content and 1，25(OH)2D3content in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

2.7 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠抗氧化能力的影響

模型組大鼠血清MDA含量顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮不同劑量組血清MDA含量顯著低于模型組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。模型組大鼠血清SOD活力顯著低于空白組(P＜0.01)，戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮不同劑量組血清SOD活力均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表4。

表4 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠血清MDA含量及SOD活力的影響(珋x±s，n=8)Table 4 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on MDA content and SOD activity in serum of premature ovarian failure rats(珋x±s，n=8)

2.8 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢組織雌激素受體的表達(dá)影響

空白組可見卵巢組織中雌激素受體在黃體中表達(dá)顯著，基質(zhì)弱表達(dá)或不表達(dá)。模型組大鼠卵巢組織雌激素受體蛋白在黃體和基質(zhì)中均呈現(xiàn)弱表達(dá)，與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.01)。戊酸雌二醇組、湖北海棠總黃酮各劑量組中，雌激素受體的表達(dá)較模型組均增強(qiáng)(P＜0.01)，在黃體組織中表達(dá)增強(qiáng)。見圖4、表5。

圖4 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢組織雌激素受體(ERα)表達(dá)的影響(×200)Fig．4 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on estrogen receptor(ER alpha)expression in ovarian tissue of premature ovarian failure rats(×200)

表5 湖北海棠總黃酮對(duì)卵巢早衰大鼠卵巢組織中ERα的表達(dá)影響(珋x±s)Table 5 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on ER－alpha expression in ovarian tissue of premature ovarian failure rats(珋x±s)

3 討論

雷公藤多苷提取自傳統(tǒng)中藥雷公藤，具有免疫抑制、抗炎作用，主要用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性腎小球腎病等自身免疫性疾病，其對(duì)生殖功能的抑制作用近年來被廣泛應(yīng)用于建立卵巢早衰的動(dòng)物模型。灌胃雷公藤多苷可損傷卵巢功能，使卵巢分泌的雌激素、孕激素減少，反饋性促進(jìn)促性腺激素分泌升高，動(dòng)情周期紊亂，導(dǎo)致卵巢功能減退和(或)衰竭［9］。本實(shí)驗(yàn)中，給予大鼠灌胃雷公藤多苷片后，通過陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠動(dòng)情周期紊亂并延長，失去各期典型的形態(tài)學(xué)特征，表明給予雷公藤多苷片后，大鼠卵巢功能被抑制，激素的周期性分泌被干擾，卵巢早衰動(dòng)物模型成功建立。

目前臨床治療卵巢早衰的常用方法有激素替代療法、誘導(dǎo)排卵法、免疫抑制劑療法等［10］，但由于其不良反應(yīng)大、療效不穩(wěn)定等原因，效果均不滿意。長期的低雌激素狀態(tài)常常會(huì)增加骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。中藥中提取的植物雌激素來源廣泛，與內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)和功能類似，當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)，植物雌激素可以發(fā)揮弱雌激素效應(yīng);當(dāng)體內(nèi)雌激素水平過高時(shí)，植物雌激素可以競爭性地結(jié)合雌激素受體(estrogen receptor，ER)，因此被稱為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selectiveestrogenreceptor modulators，SERMs)，且副作用較小，在婦女圍絕經(jīng)期綜合征中療效顯著，顯示出良好的發(fā)展前景。湖北海棠總黃酮類是湖北海棠葉提取物，其中根皮苷含量最高，有報(bào)道［11］顯示，根皮苷可與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素作用。本研究中，給予卵巢早衰大鼠湖北海棠總黃酮治療后，血清中E2、P水平顯著升高，F(xiàn)SH水平下降，子宮及卵巢重量增加，卵巢內(nèi)生長卵泡數(shù)量增多，子宮內(nèi)膜增厚，腺體分泌功能增強(qiáng)，表明湖北海棠總黃酮能夠改善POF大鼠卵巢功能，并隨劑量增加，作用隨之增強(qiáng)。ALP和BALP由成骨細(xì)胞合成，是最常見的評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)，可反映成骨細(xì)胞活性，是骨形成的特異性生化指標(biāo)［12］。血清中1，25(OH)2D3是機(jī)體活力最強(qiáng)的維生素D的代謝產(chǎn)物［13］，在骨形成過程中起著重要的作用。湖北海棠總黃酮組大鼠血清中ALP活力、BALP含量均顯著降低，1，25(OH)2D3含量均顯著升高，表明湖北海棠總黃酮能夠糾正由卵巢早衰引起的骨代謝紊亂，改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)。

線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力工廠，卵巢顆粒細(xì)胞中線粒體功能下降是卵巢早衰的早期信號(hào)［14］?；钚匝?ROS)是線粒體能量代謝產(chǎn)物，活性氧自由基主要有超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧自由基、一氧化氮分子自由基等，失去電子的自由基將進(jìn)行各種氧化還原反應(yīng)，改變或損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能［15］。超氧化物歧化酶(SOD)通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)O2－和H2O2的穩(wěn)態(tài)平衡清除ROS，消除或減輕超氧陰離子對(duì)細(xì)胞的損害。丙二醛(MDA)是顆粒細(xì)胞內(nèi)氧自由基與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。MDA的生成量不僅反映氧自由基生成與否還反映脂質(zhì)過氧化程度，因而測定MDA含量可推測脂質(zhì)過氧化程度［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，湖北海棠總黃酮能夠提高卵巢早衰大鼠血清SOD活力，降低MDA含量，通過增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力清除過剩的氧自由基保護(hù)卵巢功能。

雌激素受體是通過配體結(jié)合激活的一類核受體超家族成員，雌激素的生物效應(yīng)受到雌激素受體的調(diào)控。目前研究［17］報(bào)道其有 ERα和ERβ兩種亞型，它們既可共存也可單獨(dú)表達(dá)。二者在體內(nèi)廣泛分布，在子宮、卵巢、睪丸、骨等器官數(shù)量豐富。兩種ER的配體結(jié)合特性雖然相似，但ERα對(duì)雌二醇的親和力高于ERβ［18］。本實(shí)驗(yàn)中，湖北海棠總黃酮能夠顯著促進(jìn)卵巢組織中顆粒細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞ERα的表達(dá)，在促進(jìn)雌激素、孕激素分泌的同時(shí)，通過增加卵巢組織細(xì)胞內(nèi)雌激素受體的數(shù)量，提高雌激素的作用，恢復(fù)卵巢功能。

綜上所述，灌胃雷公藤多苷片后，成年大鼠卵巢儲(chǔ)備能力下降，表現(xiàn)出卵巢早衰典型特征。經(jīng)湖北海棠總黃酮治療后，大鼠血清雌、孕激素水平升高，生長卵泡數(shù)量增多，卵巢功能顯著改善，同時(shí)湖北海棠總黃酮通過發(fā)揮其類雌激素樣作用對(duì)卵巢早衰繼發(fā)的骨質(zhì)疏松起到治療作用。其作用機(jī)制與湖北海棠總黃酮增強(qiáng)了體內(nèi)抗氧化能力、減輕卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞損傷、增強(qiáng)顆粒細(xì)胞內(nèi)雌激素受體的表達(dá)密切相關(guān)。