何嘉 張遠(yuǎn)成 楊亞軍 劉丹 孟慶飛

唐山市豐潤區(qū)人民醫(yī)院骨一科，河北唐山064000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨組織微結(jié)構(gòu)退化，骨強度下降，骨組織脆性增加，骨折危險性增大為特點的進行性、系統(tǒng)性、全身性骨骼疾?。?］。骨折是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人們的生命健康。因此，骨質(zhì)疏松癥的及時預(yù)防和有效治療已成為當(dāng)務(wù)之急［2］。目前，臨床治療骨質(zhì)疏松的藥物主要包括激素調(diào)節(jié)藥物、加速骨形成藥物、促進骨礦化藥物等，這些藥物對治療OP有一定的療效，但也伴有一定的嚴(yán)重副作用，如長期激素治療出現(xiàn)的血液高凝狀態(tài)及誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等風(fēng)險［3］。而甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素防治OP以其安全、毒副作用小，且可全身整體調(diào)節(jié)等特點，在治療上有較大優(yōu)勢，更易于患者接受。因此，本研究探討甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用，為臨床藥物治療OP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雌性SD大鼠100只，4月齡，體重(360±30)g，訂購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號:SYXK(京)2017－0033］，重組人甲狀旁腺激素(1－34)(100μg/支，批號:1708072，美國Sigma公司)，鮭降鈣素注射液(密蓋息)(50 IU/支，批號:1609045，瑞士諾華制藥有限公司)，Ca、P、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒購于南京建成生物工程公司，7170A全自動生化分析儀購于日本日立公司，雙能X線骨密度測定儀購于美國GE公司，MTS－858型生物力學(xué)實驗機購于美國MA公司，大鼠 ER、血清骨鈣素(osteocalcin，OC)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、RANKL酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于美國R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理:100只雌性SD大鼠按隨機數(shù)字法分組:假手術(shù)組、去勢組、甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組。假手術(shù)組僅切除部分脂肪組織，去勢組、甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。造模成功后第2天給予藥物干預(yù)，假手術(shù)組、去勢組:皮下注射0.9%Nacl，1次/d;甲狀旁腺素組:皮下注射 PTH(1－34)50μg/kg，1次/d;降鈣素組:皮下注射降鈣素5～10 IU/kg，1次/d;聯(lián)合用藥組:皮下 PTH(1－34)50μg/kg，1 次/d，皮下注射降鈣素5～10 IU/kg，1次/d。

1.2.2 構(gòu)建大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松動物模型:10%水合氯醛腹腔麻醉，備皮消毒，取腹背部中線第2腰椎水平做長約2 cm縱行切口，依次分離進入腹腔，沿輸卵管尋找粉紅色卵巢組織，嚴(yán)密結(jié)扎輸卵管及其周圍血管、脂肪組織，完整切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組取出卵巢周圍等量脂肪組織，不予切除卵巢，關(guān)閉腹腔，逐層間斷縫合，術(shù)后肌肉注射青霉素［5萬U/(kg·d)］3 d，預(yù)防感染。

1.2.3 標(biāo)本取材與處理:給藥干預(yù)8周后，給予10%水合氯醛腹腔麻醉后，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血8～10 mL，高速冷凍離心3 000 r/min，10 min，EP 管收集上層血清 0.5～1 mL，－20℃保存?zhèn)溆?，待骨代謝生化指標(biāo)和標(biāo)志物檢測。逐層剝離L4腰椎和股骨，以無菌生理鹽水濕紗布包裹置于－20℃的冰箱保存?zhèn)溆?，以行腰椎和股骨骨密度和生物力學(xué)檢測。另留取股骨10%甲醛溶液固定，10%EDTA 6周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm切片，60℃烤箱4 h，取出室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 BMD和骨礦物質(zhì)含量(bone mineral content，BMC)測定:取出待測大鼠 L4腰椎和右股骨，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體掃描模式，以分辨率1.0 mm×1.0 mm，掃描速度60 mm/s，掃描寬度5.0 cm的參數(shù)值，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，檢測BMD和BMC值。

1.2.5 大鼠骨生物力學(xué)檢測:取出右側(cè)股骨，將大鼠股骨置于電子生物力學(xué)材料試驗機進行三點彎曲力學(xué)試驗，儀器調(diào)試正常后固定骨標(biāo)本位置，右股骨橫切面為準(zhǔn)，支點跨距為20 mm，加載速度2 mm/min給予股骨載荷，計算機記錄記錄儀描記載荷一變形曲線，根據(jù)荷載變形曲線得出最大荷載。

1.2.6 血清雌二醇(E2)檢測:采用ELISA法檢測血清中E2水平，參照試劑盒說明書進行逐步操作。

1.2.7 骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)檢測:取出上清液，采用7170A全自動生化分析儀檢測相關(guān)生化指標(biāo):血鈣(Ca)、血磷(P)、ALP，Ca、P、ALP 檢測均采用比色法測定，均按試劑盒說明書步驟操作。

1.2.8 骨代謝標(biāo)志物檢測:取出各組上清液樣本，采用ELISA法測定血清OC、OPG、核因子κB受體活化因子(receptor activator of NF－κB，RANK)含量，參照試劑盒說明書進行逐步操作。

1.2.9 HE染色:取出石蠟切片，參照HE染色法實驗步驟進行操作［4］，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS 20.0軟件分析，實驗數(shù)據(jù)采用珋x±s表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用單因素方差分析，組間比較采用SNK法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨組織BMD和BMC

去勢組較假手術(shù)組腰椎(L4)和股骨BMD和BMC顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺組、雌二醇組、聯(lián)合用藥組均較去勢組腰椎(L4)和股骨BMD和BMC均增高，其中尤以聯(lián)合用藥組增高最顯著(P＜0.05)。見表1。

表1各組大鼠腰椎和股骨的BMD和BMC比較(珋x±s)Table 1 Comparison of BMD and BMC between lumbar vertebrae and femur among the groups(珋x±s)

2.2 骨生物力學(xué)

假手術(shù)組、去勢組、甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組最大負(fù)荷(N)分別為:203.60±20.50、125.26±12.62、156.35±15.36、160.48±14.25、188.56±18.43。去勢組較假手術(shù)組股骨最大負(fù)荷顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢組股骨最大負(fù)荷顯著增高，其中尤以聯(lián)合用藥組增高最顯著(P＜0.05)。

2.3 血清雌二醇(E2)

假手術(shù)組、去勢組、甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組血清 E2含量(pg/mL)分別為:75.35±10.30、24.50±8.43、36.80±8.65、43.65±8.50、58.04±9.32。去勢組較假手術(shù)組股血清E2顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢組血清E2顯著增高，其中尤以聯(lián)合用藥組增高最顯著(P＜0.05)。

2.4 骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)

去勢組血清 Ca、P顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，血清ALP顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組血清Ca水平均高于去勢組，其中尤以聯(lián)合用藥組增高最顯著(P＜0.05)，甲狀旁腺組組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組較去勢組血清ALP均降低，其中尤以聯(lián)合用藥組降低最顯著(P＜0.05)。見表2。

2.5 骨代謝標(biāo)志物

去勢組血清OC、RANK水平顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組較去勢組血清OC、RANK水平均降低，其中尤以聯(lián)合用藥組降低最顯著(P＜0.05)。去勢組血清OPG水平顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組較去勢組血清OPG水平均升高，其中尤以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P＜0.05)。見表3。

表2各組大鼠血清骨代謝生化指標(biāo)比較(珋x±s)Table 2 Comparison of serum biochemical markers among the groups(珋x±s)

表3各組大鼠血清骨代謝標(biāo)志物比較(珋x±s)Table 3 Comparison of serum bone metabolism markers among the groups(珋x±s)

2.6 骨組織病理學(xué)

假手術(shù)組骨組織結(jié)構(gòu)完整，大量成熟骨組織，骨小梁粗細(xì)均勻，結(jié)構(gòu)完整，生長旺盛，排列致密有序，互相交錯呈網(wǎng)狀，成骨細(xì)胞形態(tài)清晰可見。去勢組骨小梁明顯減少，排列稀疏錯亂，部分出現(xiàn)大片斷裂現(xiàn)象，大量纖維組織，骨細(xì)胞少見，鈣鹽沉積明顯減少。甲狀旁腺組和降鈣素組骨組織結(jié)構(gòu)較完整，骨小梁相對完整，骨小梁生長稍稀疏，小梁間有少量斷裂，間隙略增大，排列尚規(guī)則，成骨細(xì)胞相對較少。聯(lián)合用藥組骨組織結(jié)構(gòu)完整，板層結(jié)構(gòu)致密，骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁致密豐實粗壯，形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整，連續(xù)性好，鈣鹽沉積。見圖1。

3 討論

骨折是OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥，骨質(zhì)疏松患者一旦發(fā)生骨折，生存質(zhì)量急劇下降，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［5］。隨著全球人口老齡化的快速進展，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率亦逐年增加。加之老年患者對OP認(rèn)識度不足，對治療的依從性差，從而導(dǎo)致臨床診治的困難增加，也加大了骨折的發(fā)生率和病殘率［6］。因此，如何防治OP和預(yù)防其并發(fā)癥就顯得極為重要。

甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是由甲狀旁腺分泌的骨代謝過程中重要的調(diào)節(jié)因子，不僅可增加成骨細(xì)胞數(shù)量，促進骨生長因子釋放，增加骨量骨密度，從而促進骨形成，而且可增強破骨細(xì)胞活性，促進骨吸收，它在維持骨穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著雙重調(diào)節(jié)作用［7］。同時，PTH還可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，促進膠原合成和骨組織礦化，且可以抑制成骨細(xì)胞的凋亡［8－9］。PTH(1－34)是甲狀旁腺素中具有活性的氨基酸序列，和PTH具有相同和相似的生物活性和作用機制，可刺激骨形成，增加骨強度，改善骨結(jié)構(gòu)和增加骨量，具有一定的成骨作用［10］。

降鈣素是調(diào)節(jié)骨代謝的重要激素，降鈣素通過與破骨細(xì)胞的受體結(jié)合，不僅能抑制破骨細(xì)胞的活性，而且還能阻止它的生成，從而抑制骨組織的自溶和吸收，減少骨骼中鈣和骨基質(zhì)的流失，抑制骨轉(zhuǎn)化［11］。同時降鈣素增加骨質(zhì)礦化，防止骨量丟失，增加骨礦含量，提高骨密度［12］。此外，研究還表明降鈣素能作用于成骨細(xì)胞，刺激成骨細(xì)胞增殖和分化，促進骨小梁的改建，促進骨折愈合［13］。鮭魚降鈣素(salmon calcitonin，sCT)是一種人工合成的生物制劑，對其受體具有很強的親和力，其活性高，且藥效更持久。由于sCT起效迅速，療效佳，使用方便，不良反應(yīng)較少，安全性更好。因此，臨床普遍用于治療骨質(zhì)疏松癥等疾病，療效逐漸被廣泛認(rèn)可。

本研究表明甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素通過提高雌激素水平，調(diào)節(jié)維持骨代謝，提高骨密度和礦物含量，改善生物力學(xué)性能，改善骨組織病理形態(tài)學(xué)，起到抗骨質(zhì)疏松的療效和骨保護作用。周蕓帆等［14］研究表明PTH(1－34)與降鈣素都能顯著提高BMD和緩解骨質(zhì)疏松癥狀，對于治療骨質(zhì)疏松安全有效。劉海蔚等［15］研究表明國產(chǎn)PTH(1－34)聯(lián)合降鈣素能明顯增加腰椎 BMD，升高骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)，治療PMOP安全有效。金成春等［16］研究表明PTH聯(lián)合sCT治療老年骨質(zhì)疏松合并Garden I股骨頸骨折是一種安全、療效更好的方法。

綜上所述，本研究表明甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素能減少骨量的丟失，促進骨礦化，提高骨密度，改善骨質(zhì)量，提高骨的生物力學(xué)特性和抗骨折能力，降低骨折的發(fā)生率。雖然甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素在治療骨質(zhì)疏松癥起到了很大功效，但仍有許多問題需要解決，如不同的給藥方法可引起的完全不同的生物效應(yīng)，用藥的準(zhǔn)確療程，長期用藥的耐藥性問題，遠(yuǎn)期并發(fā)癥及藥物具體作用機制等一系列問題限制了藥物的長期使用，隨著上述問題的解決，甲狀旁腺素和降鈣素的應(yīng)用空間將更加廣闊。

圖1HE染色觀察骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200)A:假手術(shù)組;B:去勢組;C:甲狀旁腺組;D:降鈣素組;E:聯(lián)合用藥組。Fig．1 Observation of morphological changes of bone tissue with HE staining(× 200)A:Sham operation group;B:Castration group;C:Parathyroid group;D:Calcitonin group;E:Combination group．