莊銘城 王小燕 林澤偉

普寧市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東普寧515300

世界衛(wèi)生組織將骨質(zhì)疏松定義為一種全身性骨骼疾病，其特點(diǎn)是骨量減少，微觀結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致骨骼強(qiáng)度降低，易出現(xiàn)骨折。到目前為止，通過雙能X線骨密度儀(DXA)測量骨密度(bone mineral density，BMD)是診斷骨質(zhì)疏松的常用方法。然而，監(jiān)測骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物(bone turnover markers，BTMs)是觀察骨質(zhì)疏松治療效果的有效手段［1］。BTMs的檢測是為了快速了解骨質(zhì)疏松的生理狀態(tài)和對快速骨損者的認(rèn)識。它們通常分為骨吸收標(biāo)志物、骨形成標(biāo)志物和破骨細(xì)胞控制因子［2－3］。I型前膠原前肽(type I procollagen propeptide，PINP)是從 I型前膠原中去除產(chǎn)生I型膠原的前肽之一，被認(rèn)為是Ⅰ型膠原合成的標(biāo)志。PINP濃度是使用標(biāo)志物來確定骨質(zhì)疏松患者抗吸收治療的有效性，并被國際骨壞死聯(lián)合基金會(huì)－國際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)骨標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)工作組確認(rèn)為最重要的 BTMs 之一［4－5］。PINP作為骨形成生化標(biāo)志物參考區(qū)間的建立是臨床應(yīng)用的必由之路［6］。雖然報(bào)道了不同國家人群的 PINP 參考區(qū)間［6－8］，但關(guān)于中國人群血清 PINP水平參考范圍的信息有限。因此，本研究的目的是通過自動(dòng)化方法確定中國人群中PINP值的年齡相關(guān)血清參考區(qū)間。

1 材料和方法

1.1 一般資料

納入在2017年9月至2019年1月在我院進(jìn)行一般體檢的健康人群并收集血樣。確定年齡特定的PINP參考范圍。從健康成年人(208名男性和370名女性)中收集了578份血樣，男性和女性群組的特征如表1所示。所有參與者均為健康成人，基于DXA檢測顯示BMD正常。本研究由醫(yī)院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書。

表1 受試者的基本特征Table 1 Characteristics of the subjects included in the study

1.2 PINP測定

在早上7:30至10:00之間禁食過夜后，以一致的方式收集用于PINP測量的血液樣品。使用Elec－sys總 PINP 測定法(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)在 E170模塊免疫學(xué)分析儀(Roche Diagnostics)上測量血清PINP濃度。根據(jù)制造商的規(guī)格，按照實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制程序，用單批測定試劑測量所有樣品［9］。將具有高或低PINP濃度的樣品混合以產(chǎn)生5個(gè)PINP濃度間隔。分析樣品一式三份的血清樣品。將5個(gè)混合樣品的結(jié)果與預(yù)期值進(jìn)行比較。根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)指南EP05－A3，連續(xù)5 d測量每個(gè)樣品(每天2次，每次重復(fù)2次)。將來自不同濃度的兩種不同質(zhì)量對照樣品和來自正常健康群體的5種人血清樣品用于該評估。根據(jù)CLSI指南EP17－A2，研究了PINP檢測的檢測能力。首先，測量60次重復(fù)的生理鹽水以確定空白極限(LoB;對于空白樣品可能觀察到的最高測量結(jié)果)。然后，將PINP值接近5μg/L的樣品描述為基于制造商規(guī)格的檢測下限。分析其5 d(重復(fù)5次)以確定檢測限(LoD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0版和Excel 2013軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。通過線性回歸評估測量的PINP值與預(yù)期的PINP值之間的關(guān)聯(lián)。通過方差分析計(jì)算具有95%置信區(qū)間的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精確度。為了建立參考區(qū)間，采用Tukey測試來消除異常值。然后進(jìn)行Kolmogorov－Smirnov檢驗(yàn)以分別評估亞群的PINP結(jié)果是否正常分布。如果結(jié)果的分布不是高斯分布，則進(jìn)行對數(shù)變換以歸一化分布。計(jì)算分成年齡組數(shù)十年亞群的95%置信區(qū)間，2.5%、97.5%百分位數(shù)和四分位數(shù)間距(IQR;25%～75%)的幾何平均值。與年齡相關(guān)的參考區(qū)間被建議為分布的中心95%。Mann－Whity ney檢驗(yàn)用于比較2個(gè)亞群之間的PINP水平。如果比較超過3個(gè)亞群，則使用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

混合樣品的測量值與預(yù)期值之間的回歸分析結(jié)果如圖1所示。該試驗(yàn)證明PINP的線性范圍為26.23μg/L～934.9μg/L(R2=0.9987，斜率=0.977，截距=1.945)，范圍為 26.23μg/L～934.9μg/L(R2=0.9987，斜率=0.977，截距=1.945)。重復(fù)性方差(CV)的范圍為0.93%～1.55%。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度的CV范圍為1.11%～2.85%(表2)。7個(gè)樣品的所有精密型材均低于制造商的規(guī)格。空白樣品的所有結(jié)果均為5.0 μg/L，共60次重復(fù)，因此，LoB計(jì)算為5.0 μg/L。PINP值接近5 μg/L的樣本結(jié)果范圍為5.29 μg/L～5.64 μg/L。樣品的最終 LoD 值確定為5.34 μg/L。這些結(jié)果表明本檢測方案和結(jié)果值得信任。

圖1 與預(yù)期值相比，前膠原I型N－末端前肽測量值的線性曲線Fig．1 Linearity curve of measured values of procollagen type I N－terminal propeptide compared to expected values

PINP的參考區(qū)間通過Tukey檢驗(yàn)排除異常值后，共有21名受試者(5名男性和16名女性)被排除在外。PINP的中位數(shù)和參考區(qū)間總結(jié)見表2。在男性和女性中，血清PINP中位數(shù)分別為44.2μg/L(IQR，35.5～54.0)和 41.3μg/L(IQR，32.4～55.9)。男性人口中PINP水平略高于女性。然而，這種差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.129)。當(dāng)在年齡組之間比較中位PINP水平時(shí)，男性和女性中最高的PINP水平分別在20～29歲年齡組(P=0.023)和50～59歲年齡組(P＜0.001)(表3)。

在PINP水平從20～29歲年齡組減少到30～39歲年齡組后，男性的PINP水平保持穩(wěn)定。從20～29歲年齡組到40～49歲年齡組，女性的PINP水平下降趨勢也有所減少。然而，在50～59歲年齡組的女性中，PINP水平急劇增加。詳見圖2。

表2 使用質(zhì)量控制樣品和人血清測量前膠原I型N－末端前肽的精確度曲線Table 2 Precision profiles of procollagen type I N－terminal propeptide measurement using quality control samples and human sera

表3 根據(jù)年齡組的血清前膠原I型N－末端前肽濃度的中位數(shù)和參考區(qū)間Table 3 Median and reference intervals of serum procollagen type I N－terminal propeptide concentrations according to age groups

圖2 健康中國男性(A)和女性(B)中PINP值的年齡相關(guān)分布Fig．2 Age－related distribution of P1NP values in healthy Chinese males(A)and females(B)

3 討論

在過去的10年中，已經(jīng)開發(fā)了幾種BTMs來監(jiān)測骨代謝［4］。PINP是最重要的BTMs之一，已被用于預(yù)測骨形成［10］。此外，在許多研究中，PINP水平的降低已被證明是預(yù)測骨折的標(biāo)志物［11］。在開發(fā)自動(dòng)化檢測PINP之前，手動(dòng)分析是測量PINP濃度的唯一方法，因此限制了PINP的臨床應(yīng)用。最近，針對PINP的高通量自動(dòng)化分析已被引入臨床實(shí)驗(yàn)室［12］。與手動(dòng)方法相比，這些可以滿足PINP測量日益增長的需求，縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間并提高性能。本研究獨(dú)立評估了E170模塊免疫分析儀上自動(dòng)檢測總PINP檢測的性能，并證明該檢測具有出色的線性和精確性，檢測限制非常低。特別是總PINP測定顯示在極低濃度和極高濃度之間的范圍內(nèi)接近完美的線性。此外，測定的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度分別低于2%和3%。這一特征和商業(yè)上可用的任何其他PINP分析方案一樣優(yōu)秀［13］。本研究的檢測能力測試數(shù)據(jù)還表明，在該分析的臨床應(yīng)用過程中可以準(zhǔn)確地檢測出極低濃度的PINP。

本研究發(fā)現(xiàn)中國男性人群血清PINP水平與年齡呈負(fù)相關(guān)。PINP水平隨年齡增長而降低，直至40～49歲年齡組，它達(dá)到了50～59歲年齡組的最低水平。然后，從50～59歲年齡組到60歲以上年齡組略有增加。在其他男性隊(duì)列研究中也發(fā)現(xiàn)了這種與年齡相關(guān)的U形關(guān)系［14］，這一發(fā)現(xiàn)可能反映了年輕時(shí)的骨轉(zhuǎn)換活躍。Hu等［14］的研究結(jié)果與年齡相關(guān)的參考區(qū)間和男性中位數(shù)PINP水平的結(jié)果非常相似。然而，與澳大利亞男性隊(duì)列的年齡相關(guān)參考區(qū)間相比［12］，中國男性的PINP水平在20～29歲年齡組中較低，但在其他年齡組中較高。

在中國女性人口中，20～29歲和40～49歲年齡組之間也存在負(fù)相關(guān)。在50～59歲年齡組急劇增加后，PINP水平隨年齡增長而下降。這種獨(dú)特的PINP模式已在其他國家的人群中報(bào)道［14］，這可能反映了50～59歲年齡組中絕經(jīng)后婦女的骨轉(zhuǎn)換加速［15］。比較人群中PINP水平的中位數(shù)，韓國女性的PINP水平高于澳大利亞、比利時(shí)或英國女性人群［16］。然而，它們與我國上海女性隊(duì)列的水平幾乎相同［14］。這些結(jié)果表明PINP水平在種族中可能不同。因此，在對臨床應(yīng)用采用PINP測量時(shí)，必須為每個(gè)國家或地區(qū)建立參考區(qū)間。

本研究也存在一些局限性。首先，沒有考慮其他如激素水平，盡管通過BMD數(shù)據(jù)證實(shí)了骨骼狀態(tài)的正常性。其次，由于樣本量有限，不得不以10年為單位建立參考區(qū)間。由于無法選取足夠數(shù)量的健康老年男性和女性，因此無法指定超過60歲的受試者的參考范圍。第三，沒有考慮更年期狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)女性年齡組50～59歲的PINP水平增加，然而無法得出這種增加是由于雌激素缺乏引起的絕經(jīng)后婦女。第四，根據(jù)更年期的存在，BTMs沒有對這項(xiàng)研究進(jìn)行分析。然而，這些結(jié)果可能有助于對中國人群的骨轉(zhuǎn)換狀況進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑u估。它還為中國人群提供PINP水平，以便將來與其他人群進(jìn)行比較研究。