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益腎降濁膠囊治療慢性腎功能衰竭的實(shí)驗(yàn)研究

2020-03-27 03:59高賢嫻王丹妮
人參研究 2020年1期
關(guān)鍵詞:尿蛋白空白對(duì)照腎功能

張 宸 ,高賢嫻 ,楊 楠 ,王丹妮 ,洪 鐵 ,

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,長(zhǎng)春130021;2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,長(zhǎng)春130012;)

慢性腎功能衰竭(Chronic renal failure,CRF)又簡(jiǎn)稱慢性腎衰,可由各種疾病如腎小球腎炎、泌尿系統(tǒng)先天畸形、遺傳性疾病等逐漸發(fā)展而來(lái)[1]。CRF進(jìn)展緩慢,但病程發(fā)展一般不可逆,而且病程的某一階段可呈進(jìn)行性發(fā)展和加重,直至發(fā)展成尿毒癥。目前患得該病的人數(shù)達(dá)到數(shù)千萬(wàn),臨床上主要采取透析、降脂、抗聚、抗凝等治療措施以緩解CRF癥狀并延緩病程發(fā)展[2~3]。近年來(lái),CRF也引起了中醫(yī)藥研究者的關(guān)注,益腎降濁膠囊具有補(bǔ)腎健脾、益氣利水的功效,又可以逆降清濁、活血化瘀。本文通過制備CRF大鼠模型并灌胃給予益腎降濁膠囊進(jìn)行干預(yù)治療,探討益腎降濁膠囊對(duì)CRF的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠,雄性,體質(zhì)量180~200g,由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)清潔環(huán)境中,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食,適應(yīng)一周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

益腎降濁膠囊由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院提供,該研究中使用的每g藥膏相當(dāng)于生藥約4.55g;腎衰寧膠囊由云南理想藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Scr測(cè)定試劑盒、BUN測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

代謝籠,上海澤雅科教儀器有限公司;BS-124S電子天平,北京塞多利斯系統(tǒng)有限公司;微量移液器,賽默飛世爾儀器有限公司;代謝籠,上海澤雅科教儀器有限公司;超純水系統(tǒng)(AFZ-1002-U),艾科普儀器有限公司;TGL-16B離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,Biotek公司;倒置顯微鏡,德國(guó)LEICA公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 陽(yáng)離子化牛血清白蛋白的制備

按照文獻(xiàn)[4]的方法,取67ml的無(wú)水乙二胺液,加入500ml雙蒸水,再加入6mol/l的鹽酸350ml,調(diào)整PH至4.75,冷卻至25℃,進(jìn)行攪拌,再加入天然牛血清白蛋白(N-BSA)5g溶于25ml重蒸餾水的溶液,攪拌完全后再加入1.8g炭化二亞胺鹽酸鹽(EDCHCI)維持25℃,持續(xù)攪拌2h,保持PH值4.75,最后加4mol/l的醋酸緩沖液30ml,終止反應(yīng),即得到等電點(diǎn)提高的C-BSA溶液,將C-BSA溶液置于透析袋中,用4℃的雙蒸水透析72h(3~5h換水一次),冷凍干燥后,即得BSA凍干粉。密封保存于80℃冰箱內(nèi),注射前用0.01mol/l的PH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成溶液。

2.2 構(gòu)建模型

按照文獻(xiàn)[5]的方法建立膜性腎病模型,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,測(cè)24h尿蛋白,選擇24h尿蛋白正常的SD大鼠60只,10只作為空白對(duì)照組,另外50只進(jìn)行預(yù)免疫和致病免疫。預(yù)免疫:C-BSA100mg溶于3.75mlPBS中,加入26.25ml弗氏不完全佐劑充分混合乳化,除正常組外,在其余大鼠的雙側(cè)腋下、背部及腹股溝多個(gè)位置皮下注射(每只大鼠注射0.3ml,每點(diǎn)注射不超過0.05ml),每隔1日進(jìn)行1次。致病免疫:在預(yù)免疫一周后,開始正式免疫,大鼠每隔1日尾靜脈注射C-BSA3.5mg/只,每周注射3次,連續(xù)注射4周。

2.3 動(dòng)物分組及給藥

未進(jìn)行模型制作的10只大鼠作為空白對(duì)照組,將模型大鼠分為模型對(duì)照組、腎衰寧組、益腎降濁膠囊高、中、低劑量組,每組10只。每天灌胃給藥一次,正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予同體積蒸餾水,連續(xù)給藥6周。

2.4 觀察及檢查指標(biāo)

2.4.1 大鼠一般情況

治療完成后,觀察各組大鼠的一般生存狀況,包括精神狀態(tài)、外觀、飲食狀況、死亡情況等。

2.4.2 24h尿蛋白量

分別于造模結(jié)束第0周、第2周、第4周、第6周將大鼠置于代謝籠中,收集大鼠的24h尿液,并記錄尿量,測(cè)定24h尿蛋白量。

2.4.3 血清腎功能指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血,檢測(cè)血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的含量,具體方法按照試劑盒標(biāo)示方法進(jìn)行。

2.4.4 腎臟組織病變的觀察

取大鼠右側(cè)腎臟置于4%的多聚甲醛溶液固定72h,然后進(jìn)行石蠟包埋、切片、展片和蠟脫水化處理,在常規(guī)HE染色后通過導(dǎo)致光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2.4.5 SOD活性和MDA含量的測(cè)定

取左側(cè)腎臟、加入適量裂解液進(jìn)行研磨勻漿,離心后取上清液,測(cè)定腎臟組織的超氧化物歧化酶SOD活性和MDA含量,具體方法按照試劑盒標(biāo)示方法進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

收集數(shù)據(jù),采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析,根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性,定量資料以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

空白對(duì)照組的大鼠精神狀態(tài)佳,飲食飲水正常,毛色光澤順滑,體重逐漸增加。在造模過程中未出現(xiàn)大鼠的死亡,但模型組的大鼠呈現(xiàn)精神不振,反應(yīng)遲鈍,食量明顯減少,飲水大量增加,尿量明顯增多,毛色發(fā)黃、無(wú)光澤。經(jīng)益腎降濁膠囊給藥治療后,各藥物組大鼠的精神狀態(tài)隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而精神狀態(tài)逐漸變好,活動(dòng)強(qiáng)度增加,進(jìn)食量增加明顯。

3.2 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠24h尿蛋白定量的影響

造模結(jié)束后,在進(jìn)行給藥治療前模型組與各給藥組24h尿蛋白量無(wú)顯著性差異(P>0.05);與空白對(duì)組相比,模型對(duì)照組與給藥組24h尿蛋白量明顯增加(P<0.01)。經(jīng)益腎降濁膠囊治療6周后,各組大鼠的24h尿蛋白明顯低于模型組,結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)果見表 1。

表1 各組大鼠不同時(shí)段24h尿蛋白定量

3.3 益腎降濁膠囊對(duì)血清腎功能監(jiān)測(cè)指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組相比,CRF模型組大鼠血清中的Scr與BUN含量顯著增加(P<0.01);與模型組相比,益腎降濁膠囊給藥組組均能降低CRF模型大鼠的Scr和BUN的含量,具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠血清中Scr和BUN的影響

3.4 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠腎組織病理學(xué)的影響

通過對(duì)各組大叔腎組織病理分析顯示,空白對(duì)照組大鼠的腎組織腎小球結(jié)構(gòu)與數(shù)量正常,腎小管結(jié)構(gòu)正常,官腔未見萎縮。模型組大鼠的腎組織存在局部腎單位萎縮、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性,腎小球囊腔及腎小管存在明顯擴(kuò)張,腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)益腎降濁膠囊治療后,上述病理變化較模型組顯著改善。結(jié)果見圖1。

3.5 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠腎臟組織SOD活性和MDA含量的影響

圖1 益腎降濁膠囊組對(duì)CRF大鼠病理變化的影響(HE 400)

與空白對(duì)照組相比,模型組的SOD活性顯著降低(P<0.01);經(jīng)益腎降濁膠囊治療6周后,與模型組相比,各治療組的SOD活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比,模型組的MDA含量明顯高于空白對(duì)照組,有顯著性差異(P<0.01);與模型組相比,益腎降濁膠囊給藥組的MDA的含量降低明顯,具有顯著性差異。 (P<0.05)。 結(jié)果見表 3。

表3 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠抗氧化酶和MDA含量的影響

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)SD大鼠尾靜脈注射C-BSA 4周后,動(dòng)物出現(xiàn)萎靡不振、脫毛、攝食減少等反應(yīng),出現(xiàn)大量蛋白尿、血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)顯著增加,說(shuō)明腎功能嚴(yán)重受損。并且在光學(xué)顯微鏡下觀察到腎小球、腎小管的病變,說(shuō)明膜性腎病誘發(fā)大鼠慢性腎衰是成功的。

CRF主要病機(jī)是氣機(jī)升降失常[6],中藥對(duì)于慢性疾病的治療有獨(dú)特之處,中醫(yī)認(rèn)為該病屬于“關(guān)格”、“癃閉”、“水腫”等范疇[7~8]。 因此,對(duì)于 CRF 的治療,在健脾補(bǔ)腎、祛濕化濁、活血化瘀的基礎(chǔ)上,還要考慮運(yùn)用藥物的四氣五味、升降浮沉來(lái)恢復(fù)臟腑的氣機(jī)的升降特性。益腎降濁膠囊是吉林省中醫(yī)科學(xué)院臨床專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出的方劑。該藥物由熟地黃、杜仲、補(bǔ)骨脂、仙靈脾、女貞子、紅參、黃芪、白術(shù)等十二味中藥組成,方中以熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰、益腎填精,杜仲溫補(bǔ)肝腎,二者相伍,雙補(bǔ)腎之陰陽(yáng),共為君藥。補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯陽(yáng)、固精暖脾,仙靈脾補(bǔ)腎壯陽(yáng),黃芪健脾補(bǔ)氣,利水消腫,紅參大補(bǔ)元?dú)猓恼呒纯芍幵鰪?qiáng)補(bǔ)腎溫陽(yáng)之力,又可健脾益氣、利水消腫,共為臣藥。其他六種中藥助君臣增強(qiáng)補(bǔ)腎健脾、益氣利水之效,又可泥降清濁解毒,兼有活血化瘀之功,全方共奏補(bǔ)腎健脾、降逆清濁之效。

本文通過對(duì)CRF大鼠采用益腎降濁膠囊治療后,檢測(cè)各組大鼠的腎功能指標(biāo),結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比,模型組大鼠的24h尿蛋白量,血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平顯著升高。經(jīng)過益腎降濁治療后,治療組的大鼠的腎功能指標(biāo)顯著降低。通過對(duì)大鼠組織進(jìn)行病理分析顯示,益腎降濁膠囊能夠明顯改善腎組織的萎縮、擴(kuò)張等情況。同時(shí),益腎降濁膠囊能夠提高SOD活性、降低MDA,具有明顯的抗氧化作用。氧化應(yīng)激是腎臟疾病進(jìn)展的重要因素,益腎降濁膠囊能夠增加機(jī)體中SOD活性從而提高機(jī)體清除氧自由基的能力,減輕自由基對(duì)腎小球的損傷,從而延緩慢性腎衰的進(jìn)程。

綜上所述,益腎降濁膠囊可改善大鼠一般生存狀態(tài)、改善腎功能、抑制腎臟組織病變,產(chǎn)生抗氧化作用,說(shuō)明益腎降濁膠囊能夠緩解大鼠慢性腎功能衰竭。

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