劉 新，吳定桂,，江和龍，宋 娜**

(1:南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，江蘇省環(huán)境工程重點實驗室，南京 210037)(2:中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

天然水體中ROS的來源主要為水體中DOM的光化學反應[14-15]，尤其是其中的有色可溶性有機物(CDOM)組分. CDOM是一類含有苯環(huán)、羧基和羰基等發(fā)色團的復雜混合有機物，能夠吸收特定波長的太陽光. 在水生生態(tài)系統(tǒng)中，藻型湖區(qū)、草型湖區(qū)存在環(huán)境具有顯著性差異[16]，維持穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)狀態(tài)的機理也完全不同，水體中DOM的來源及組分特征也存在較大差異，其中草型水生植物衰亡期植物殘體的腐爛分解是湖泊水體中DOM的重要來源，然而目前關于草源型DOM釋放ROS的過程并不清楚[17].

實際上，對于湖泊系統(tǒng)尤其是淺水湖泊來說，由于其具有更高的透光性，更強的水土界面物質(zhì)交換，從而更易受外界環(huán)境影響[18]. 因此，隨著全球氣候變暖，湖泊富營養(yǎng)化，沼澤化過程使得河床被抬高，以及水生植被生態(tài)修復技術的推廣運用，刺激了淺水湖泊中水生植物的過量生長[19]. 一方面水生植物在去除污染物、凈化水質(zhì)、改善水體治理以及恢復水體生態(tài)功能等方面發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生的ROS在去除污染物如有機污染物、重金屬等方面同時發(fā)揮作用[20]；另一方面，過量水生植物存在下，產(chǎn)生的大量ROS有可能對生態(tài)系統(tǒng)造成危害. 開展草型湖區(qū)水生植物產(chǎn)生ROS過程及機理的研究，既有利于了解水生植物產(chǎn)生ROS的環(huán)境行為，也有利于提高水生植物對水體污染物凈化能力的認識.

本研究通過室內(nèi)模擬實驗，首先參考并選擇了3種ROS(3CDOM*、1O2、·OH)的測定方法，接著選取了鄱陽湖具有代表性的草原植物——苔草(Carextristachya)，獲得典型草源型DOM提取液，分析了其DOM降解過程中ROS的產(chǎn)生過程及機理. 該研究對認識湖泊生態(tài)系統(tǒng)中DOM產(chǎn)生ROS的過程、遷移、轉(zhuǎn)化、歸宿及其作用機制具有重要的意義，在湖泊環(huán)境治理方面有重要的應用價值，同時為水生植物的生態(tài)修復功能提供重要的理論支持，以期對濕地生態(tài)系統(tǒng)修復提供一定的科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

植物樣品苔草(Carextristachya)采自于鄱陽湖南磯濕地國家級自然保護區(qū)(圖1)，裝入聚乙烯密封袋，帶回實驗室，先用自來水沖洗附著泥土，再用去離子水沖洗3遍后，用吸濕紙去除表面水分. 將植株莖和葉剪約為5 mm長度，混勻后放入坩堝中于60℃烘干至恒重. 稱取20 g烘干樣品，置于5 L廣口燒杯中，添加4 L蒸餾水，避光、室溫放置2天，獲得DOM浸出液[21].

圖1 鄱陽湖采樣點位Fig.1 The sampling site in Lake Poyang

DOM浸出液用0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾，再用0.22 μm濾膜過濾微生物后，分別取400 mL浸出液加入到500 mL廣口石英瓶中，并加入捕獲劑，每組做3個重復. 放置在溫度為25℃的光照培養(yǎng)箱下，光源為紫外燈(UVA-340，40 W，LH儀器有限公司，北京，中國)，并且避免其它光源干擾. 對照組用錫箔紙做避光處理. 無DOM的對照組為純水中添加實驗初始濃度捕獲劑. 在實驗一周內(nèi)，每天按時采集DOM降解液. 水樣在2 d內(nèi)完成理化、光學指標的測定.

1.2 檢測及計算方法

1.2.1 ROS測定方法 本實驗中測定3種ROS：3CDOM*，1O2和·OH，分別用2，4，6-三甲基苯酚(TMP)、呋喃甲醇(FFA)和苯酚進行捕獲[22-23]，捕獲劑同時添加，初始濃度分別為1、1、2 mmol/L，其中·OH檢測產(chǎn)物為苯酚. 測定在高效液相色譜儀(Agilent 1200 series)上進行，紫外檢測器進行檢測，所有樣品用甲醇和磷酸鹽緩沖液(pH 2.8)洗脫，洗脫液為60∶40(甲醇∶磷酸鹽緩沖液)混合物，流速為1.0 mL/min，TMP保留時間11 min，F(xiàn)FA保留時間3.4 min，·OH檢測產(chǎn)物苯酚保留時間4.3 min，檢測波長為220 nm. 測定TMP、FFA、苯酚的標準曲線，以及DOM降解過程中3CDOM*、1O2和·OH的濃度.

1.2.2 紫外光譜測定 CDOM吸收光譜采用SHIMADZU UV-2550紫外可見分光光度計進行全波段掃描，掃描波長范圍為200～800 nm，比色皿為1 cm的石英槽，以Mili-Q水作空白，按公式(3)～(4)進行計算[24]：

a′(λ)=2.303×OD(λ)/r

(3)

a(λ)=a′(λ)-a′(700)·λ/700

(4)

式中，a′(λ)和a(λ)分別為未經(jīng)散射校正和經(jīng)過散射校正過后波長λ處的吸收系數(shù)，m-1；r為比色皿光程，m；OD(λ)為樣品在波長λ處的吸光度值.

本文采用波長280 nm的CDOM吸收系數(shù)來表征CDOM濃度[25]. CDOM的光譜特征是由DOM的組分和濃度共同決定的，通過如下公式[26]將CDOM吸收系數(shù)標準化，可表征單位DOC濃度的CDOM對光的吸收能力:

a*(λ)=a(λ)/[DOC]

(5)

式中，a*(λ)為波長λ處的CDOM比吸收系數(shù)，L/(mg·m).

吸收光譜斜率S值的確定：CDOM吸收光譜從紫外到可見波長隨波長的增加大致呈現(xiàn)指數(shù)衰減規(guī)律，公式為[27]：

a(λ)=a(λ0) exp[S(λ0-λ)]

(6)

本文采用光譜斜率比值(SR)表征CDOM分子量的變化，其計算方法為[28]：

SR=S(275-295)/S(350-400)

(7)

1.2.4 三維熒光光譜測定 水樣稀釋10倍后采用三維熒光分光光度計(Hitachi F-4500)測定水樣的三維熒光光譜(EEMs). 激發(fā)波長(Ex)和發(fā)射波長(Em)的掃描區(qū)間分別為200～450和250～600 nm，步長分別為5和1 nm，掃描速率為2400 nm/min，帶寬裂縫均為5 nm，光電倍增管電壓為800 V. 掃描光譜進行儀器自動校正，以Milli-Q水作為空白.

在了解頂板結(jié)構特點及頂板運動規(guī)律、保證安全生產(chǎn)的基礎上，對現(xiàn)有支架進行升級。目前支架存在的主要問題是其工作阻力無法充分發(fā)揮，對頂板控制效果差，來壓時支架動載系數(shù)及活柱縮量大。提高現(xiàn)有支架對頂板控制效果，主要從提高支架額定工作阻力和支架工作阻力發(fā)揮效率2個方面著手。

1.3 統(tǒng)計分析

采用MATLAB進行數(shù)據(jù)擬合. 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P>0.05表示未達到顯著檢驗水平；0.01

2 結(jié)果與討論

2.1 ROS測定方法的構建

表1 3CDOM*、1O2和·OH標準曲線及其檢測范圍

圖2 草源型DOM及對照組降解過程中DOC濃度Fig.2 Changes of DOC concentration during degradation of grass-source DOM and control group

2.2 草源型DOM降解過程中DOC變化情況

DOM光化學降解有兩個途徑，一是直接光降解，即溶解性有機質(zhì)直接吸收光的能量發(fā)生的降解變化，另一個是間接光解，通過光照過程中生成的ROS的氧化作用；水中存在的中間介質(zhì)吸收光子經(jīng)過電子轉(zhuǎn)移過程將能量傳遞給有機質(zhì)，激發(fā)態(tài)的有機質(zhì)進一步反應生成ROS[34]，在光降解DOM產(chǎn)生ROS的過程中，DOC是一項直接反映DOM降解情況的指標. 如圖2所示，DOC濃度從初始的1906.8 mg/L降為實驗結(jié)束后的275.4 mg/L，紫外條件下草源型DOM浸出液光降解效果顯著. 在降解中后期(2～8 d)，DOC濃度在持續(xù)下降，在2～4 d期間降幅較大，之后平穩(wěn)下降. 另外本實驗設置了無光無微生物的對照組，實驗結(jié)果顯示無光無微生物處理下對DOC的降解沒有影響. 另外在無DOM的對照組中，DOC濃度變化同樣很低，推測主要由于3種捕獲劑——TMP、FFA和苯在短時間內(nèi)光降解反應速率很低的原因[35-36].

2.3 草源型DOM降解過程中ROS變化

在DOM降解過程中，從ROS產(chǎn)生來看3種自由基濃度均隨著降解時間的延長而都有明顯的增加(圖3)，其中·OH累積濃度在第7天和第8天有一定程度的下降. 實驗結(jié)束時，3CDOM*累積濃度與1O2相近，分別為0.87和0.99 mmol/L，而最少累積濃度的ROS為·OH，為0.026 mmol/L. 本實驗證實了草源型DOM能夠在光分解過程中產(chǎn)生大量ROS，并且ROS隨時間增加而逐漸上升. 并且這種關系與捕獲劑的選擇性加入密不可分，捕獲劑持續(xù)捕獲DOM降解過程產(chǎn)生的ROS，在隨著時間的推移而逐漸累積的過程中，既保證了ROS不會長時間處于游離狀態(tài)，也阻止了ROS參與其它化學反應，使得ROS能夠穩(wěn)定累積.

圖3 DOM降解過程中3CDOM* (A)、1O2(B)、·OH (C)的濃度變化Fig.3 Changes of 3CDOM* (A), 1O2(B) and·OH (C) concentrations during the degradation of DOM

2.4 草源型DOM分解過程中ROS產(chǎn)生機理分析

2.4.1 CDOM對ROS產(chǎn)生的影響 由圖4A可知，捕獲劑對光譜吸收系數(shù)影響較小. 在此基礎上分析CDOM的光譜吸收系數(shù). CDOM光譜吸收系數(shù)總體上呈現(xiàn)指數(shù)形式單調(diào)衰減，200～250 nm處紫外波段吸收系數(shù)最大，350 nm以后的波段吸收曲線較為平滑(圖4B)，這與國內(nèi)外學者公認的CDOM光吸收特征相符合，因此CDOM在光降解過程中吸收度的減小具有不均衡性，對光的吸收也具有選擇性，吸收損失都主要發(fā)生在320 nm以下的紫外區(qū)，其中UVB(275～320 nm)波段無論對陸源DOM，還是對生物自生源的DOM，都是最有效的輻照光譜區(qū)[21]. 在275 nm附近存在一顯著的肩，該肩值與Warnock等[37]的報道結(jié)果一致，并且肩峰隨著DOM光解時間的增加而增強，從實驗初期無肩峰到后期肩峰突出十分明顯. 然而，隨著DOM降解時間的增加，CDOM相對濃度在第2天略微下降后開始上升，在第8天達到最大值. 另外，圖4C給出了光譜斜率比值SR，SR表征CDOM的平均相對分子量，根據(jù)SR與相對分子量呈反比的關系可以看到隨著DOM光解時間的增加，CDOM分子量逐漸降低，說明大分子逐漸被光降解為小分子.

圖4 DOM和捕獲劑的的紫外可見吸收光譜(A)和CDOM比吸收系數(shù)隨波長的變化(B)及CDOM相對濃度和光譜斜率比值SR(C)Fig.4 Uv-vis spectra of DOM samples and probes (A) and CDOM absorption coefficient with different wavelengths (B) and relative concentrations of CDOM and spectral slope ratio SR(C)

進一步分析表明，隨著DOC濃度的降低，CDOM組分中容易光降解部分先得到快速降解，a*(280)先有微弱降低(圖4B)，后剩余難光降解部分，光解速度較慢，但由于DOC在持續(xù)降低，標準化后的CDOM吸收系數(shù)(a(280)/[DOC])在第2～8天能夠呈現(xiàn)明顯上升趨勢，整體與ROS累計含量呈現(xiàn)正相關關系(表2)，尤其與3CDOM*、1O2濃度顯著性水平較好(P=0.031、0.035)，相關系數(shù)分別為0.753、0.742. 雖然CDOM與·OH 呈現(xiàn)正相關關系，但顯著性水平一般(P=0.231). 結(jié)果證明ROS的產(chǎn)生與DOM中的光敏感物質(zhì)——CDOM密切相關，CDOM中含有大量的發(fā)色基團，是重要的天然光敏劑，在紫外輻射或太陽光照射下吸收光子能量，引發(fā)一系列反應. 單線態(tài)(state DOM singlet，1DOM)分子吸收光能先轉(zhuǎn)化為激發(fā)單線態(tài)(excited state DOM singlet，1DOM*)，進而轉(zhuǎn)化為激發(fā)三線態(tài)(excited state DOM triplets，3DOM*)(公式(8))，進一步與溶解氧分子等發(fā)生一系列反應(公式(9)～(12))，產(chǎn)生3CDOM*、1O2、·OH等活性中間體[36].

CDOM + hυ →1CDOM →3CDOM*

(8)

3CDOM*+ H2O(OH-) → CDOM-H· +·OH(CDOM-·+·OH)

(9)

3CDOM*+ O2→ CDOM +1O2

(10)

3CDOM*+ R → CDOM-· + R-·

(11)

(12)

表2 CDOM含量與3CDOM*、1O2、·OH濃度的相關系數(shù)

Tab.2 Correlation coefficient CDOM content and the concentration of 3CDOM*, 1O2 and ·OH

系數(shù)ROS3CDOM*1O2·OHr0.7530.7420.478P0.0310.0350.231

(13)

HNO2+ hυ→·OH +·NO

(14)

圖5 DOM降解過程中水體中和DOP(F)濃度Fig.5 The concentrations of TN(A), DIP(E) and DOP (F) in the water during the degradation of DOM

2.4.3 DOM光解過程產(chǎn)物熒光分析 圖6為DOM光解過程中3D-EEMs圖. 從DOM降解液中發(fā)現(xiàn)了強烈的類蛋白熒光峰[39]，其中B2激發(fā)波長最大值分別在225 nm處，發(fā)射波長最大值在306 nm處，為低激發(fā)光絡氨酸熒光組分；B1(275 nm/306 nm)為類絡氨酸熒光組分[40]. 隨著光解時間的增加，這兩個區(qū)域的熒光強度明顯減弱，在處理第8天后，絡氨酸熒光峰(Peak B2)幾乎完全消失，僅在Ex/Em= (220～250) nm/(300～350) nm殘留很弱熒光峰，而類絡氨酸峰熒光指數(shù)FI衰減率也達到了80%(圖6C)，表明DOM發(fā)生了顯著的光化學降解，主要為類蛋白分子的降解.

表3 ROS與水質(zhì)參數(shù)的相關系數(shù)

同時有著較強的紫外激發(fā)波段的類蛋白分子證明CDOM吸收光譜在紫外波段迅速衰減變化的現(xiàn)象. 本研究在紫外光照條件下，對在低激發(fā)類蛋白熒光峰的強度變化與ROS進行相關性分析發(fā)現(xiàn)(表4)，類蛋白熒光峰值強度與ROS累積濃度呈現(xiàn)明顯負相關關系，其中類絡氨酸熒光組分峰值強度與ROS濃度之間具有較高的顯著性水平(P=0.001)，r在-0.976～-0.938之間. 低激發(fā)光絡氨酸熒光組分與ROS累計濃度呈現(xiàn)出同樣極高的顯著性水平(P=0.001)和相關性. 進一步說明了在DOM的光降解過程中蛋白質(zhì)分子的降解是產(chǎn)生ROS很重要的一個部分. 目前，Zhang等[41]通過比較污水DOM中各組分產(chǎn)生ROS的情況，也發(fā)現(xiàn)含有大量的多肽類和蛋白質(zhì)的親水性成分相比疏水性成分和中性成分可產(chǎn)生更多的ROS.

圖6 DOM降解第1天和第8天的EEMs譜圖(A, B)及類蛋白熒光組分峰強變化(C)Fig.6 The EEMs spectra of the first and eighth day(A, B) and changes of fluorescence component peak intensity of protein-like proteins during the degradation of DOM(C)

表4 ROS與類蛋白熒光組分峰值強度的相關系數(shù)

Tab.4 The correlation coefficient between ROS and fluorescence component peak intensity of protein-like proteins

ROSFI(Peak B1)FI(Peak B2)rPrP3CDOM*-0.9380.001-0.9610.0011O2-0.9760.001-0.9610.001·OH-0.9410.001-0.9590.001

3 討論

本研究中，CDOM吸收光譜從紫外到可見區(qū)通常情況下都可近似呈指數(shù)形式降低，但DOM降解液在275 nm處出現(xiàn)肩峰，破壞了這種指數(shù)衰減規(guī)律，這種現(xiàn)象在污染比較嚴重的太湖[42]、廈門筼筜湖及一些近海海域[37]也有觀測到，但還沒有非常明確的解釋．并且肩峰隨著DOM光解時間的增加而增強，從實驗初期無肩峰到后期肩峰突出十分明顯．綜合考慮在太湖、筼筜湖等的觀測結(jié)果，推測該峰的出現(xiàn)和增強或可用來指示水環(huán)境中現(xiàn)場生物(如藻類、草類、微生物)活動對CDOM的貢獻，同時也反映了水體中草類DOM光學性質(zhì)的變化，導致了結(jié)構或性質(zhì)有所不同的CDOM的產(chǎn)生[43].

另外在本研究中，DOM降解液的熒光指數(shù)FI≥2.08，是典型水體植物釋放液. 有研究發(fā)現(xiàn)B1(275 nm/305 nm)為陸源物質(zhì)的光化學降解產(chǎn)物，Peak B2也與文獻中提到的C5峰十分相近，解釋為光化學降解產(chǎn)物[44]. 水體中也經(jīng)常存在陸源DOM的匯入，使水環(huán)境中DOM組成和結(jié)構更豐富. 由于自然水體的復雜性，DOM產(chǎn)生ROS的過程會隨著不同類型DOM和其他影響因素的改變而變化，不同形成環(huán)境DOM產(chǎn)生ROS的能力有所不同，比如一般陸源DOM產(chǎn)生1O2的能力整體上要強于水源DOM，并且不同來源的DOM其產(chǎn)生1O2的能力也存在差異[45].

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，草型DOM的ROS光化學行為研究有助于了解水體中污染物的轉(zhuǎn)化機制及其環(huán)境歸趨. 由DOM介導或直接產(chǎn)生的ROS對于本身光化學活性差或者沒有光化學活性的污染物可以進行直接光解，但對于本身具有光化學活性、可以直接光解的污染物，DOM會抑制其光化學轉(zhuǎn)化和降解. 不同來源的DOM都會具有一些光吸收的基團，都存在不同程度的光吸收，如本研究草型DOM中的類蛋白分子在UVB波段的顯著吸收，因此DOM對污染物的光屏蔽是一個相對普遍的抑制機制. 同時對于本研究中的草型DOM釋放不同ROS來看，每種ROS的產(chǎn)生速率也有較大差異，對于不同性質(zhì)、不同來源的水體釋放ROS能力有差異，產(chǎn)生的ROS種類、濃度及行為都有不同，并且不同的光解反應、光解條件或光解時段下可能是不同的ROS占主導[4].

4 結(jié)論

1)利用TMP、FFA和苯的混合捕獲劑優(yōu)化了3CDOM*，1O2和·OH的測定方法，對DOM光降解過程中產(chǎn)生3CDOM*，1O2和·OH的累積濃度進行檢測.

2)3CDOM*的釋放量相較于1O2和·OH最多，·OH釋放量低于3CDOM*和1O2兩個數(shù)量級.

3)DOM降解過程中，CDOM與ROS累計濃度呈現(xiàn)正相關關系，與3CDOM*和1O2濃度顯著性水平較好，進一步證明CDOM是產(chǎn)生ROS的重要來源和介導.

5) 類蛋白熒光峰值強度的衰減與ROS累積濃度呈現(xiàn)明顯負相關關系，說明在DOM的光降解過程中蛋白質(zhì)分子的降解是產(chǎn)生ROS很重要的一個部分.