摘 要：應用組織切片和免疫組織化學的方法在中國鱟腦神經(jīng)中定位了3種離子通道的分布。研究檢測到Na+通道和K+通道免疫陽性細胞和陽性纖維，但沒有檢測到Ca2+通道的免疫陽性。Na+通道主要分布在中間體神經(jīng)纖維網(wǎng)和背面中央細胞群，K+通道分布于背面?zhèn)群蠓降诙毎汉捅趁嬷醒爰毎骸?/p>

關鍵詞：中國鱟（Tachypleus tridentatus）;離子通道;免疫組化

中國鱟（Tachypleus tridentatus）隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、螯亞門（Chelicerta）、肢口綱（Merostomata）、劍尾目（Xiphosura），其存在于世已有數(shù)億年的歷史，被稱為“活化石”，是一種具有極其重要科研價值的生物，一直是國內(nèi)外學者感興趣的研究對象[1]。國內(nèi)學者對中國鱟的研究主要集中在保護區(qū)建設、人工育苗[2]、復眼形態(tài)[3]、抗菌肽研究[4]和性腺、胚胎發(fā)育[5-7]方面，有關中國鱟神經(jīng)器官的研究卻鮮有報道，筆者曾利用組織切片，HE染色研究了中國鱟腦神經(jīng)節(jié)的形態(tài)結構[8]，利用免疫組化分析了5羥色胺（5-HT）和促性腺激素釋放激素（GnRH）在中國鱟腦神經(jīng)節(jié)的分布[9-10]。本實驗利用免疫組織化學方法，對中國鱟腦神經(jīng)節(jié)內(nèi)Na+、K+、Ca2+通道進行了定位，旨在為中國鱟神經(jīng)內(nèi)分泌的研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成體中國鱟購買于廈門市第八水產(chǎn)品市場，雄鱟殼寬為21～25 cm，雌鱟殼寬為25～31 cm?？焖偃コ袊c背部外殼，其消化道位于鱟身體中軸線位置。沿著消化道向食道方向剝離其他組織，可見圍咽神經(jīng)環(huán)位于食道靠近口的部位。腦神經(jīng)節(jié)即為圍咽神經(jīng)環(huán)的前部。

1.2 實驗試劑

Ca2+通道抗體（ab93606）和Na+通道抗體（ab56240）購于Abcam公司，K+通道抗體（p4872）購與Sigma公司。DAB顯色試劑盒和羊抗兔SABC免疫細胞化學試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗步驟

迅速解剖出腦神經(jīng)節(jié)，于波恩氏液4 ℃固定過夜。組織塊經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、透蠟，包埋后連續(xù)切片，切片厚度為7 μm。

切片脫蠟至水;3% H2O2-PBS溶液室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;滴加正常山羊血清（1∶10）室溫孵育10 min;滴加5-HT兔抗體（1∶8 000），陰性對照實驗采用正常羊血清代替一抗，4 ℃孵育過夜;PBS 浸洗三次;滴加生物素標記羊抗兔IgG;室溫反應30 min;PBS浸洗三次;滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫反應20 min;PBS浸洗三次;0.06% DAB顯色5～10 min;蘇木精復染，脫水，透明，封片，Olympus BX51型顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果

研究發(fā)現(xiàn)中國鱟腦中分布著Na+和K+通道免疫陽性細胞和神經(jīng)纖維，Ca2+通道在腦神經(jīng)節(jié)所有的區(qū)域呈免疫陰性。所有結果如表1所示。

Na+通道存在于中國鱟腦神經(jīng)節(jié)中的視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓的少數(shù)神經(jīng)纖維中，視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓的細胞體中沒有發(fā)現(xiàn)Na+通道的陽性反應。在中間體中Na+通道分布在神經(jīng)纖維網(wǎng)的外側(cè)的少數(shù)神經(jīng)纖維，中間體細胞群沒有Na+通道的陽性反應。在背面中央細胞群的腹面靠近蕈形體前葉處存在著Na+通道的陽性細胞，這些細胞直徑為15～30 μm。另外在蕈形體和蕈形體周圍的細胞沒有發(fā)現(xiàn)Na+通道的陽性反應。在中央神經(jīng)纖維網(wǎng)中有部分靠近圍咽神經(jīng)環(huán)后方的神經(jīng)纖維表現(xiàn)出Na+通道免疫陽性（如圖1）。

K+通道存在于中國鱟腦神經(jīng)節(jié)中的視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓的少數(shù)神經(jīng)纖維中，視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓的細胞體中沒有發(fā)現(xiàn)K+通道的陽性反應。在中間體中K+通道分布在神經(jīng)纖維網(wǎng)的外側(cè)和兩臂的神經(jīng)纖維，其陽性較強。中間體細胞群和背面中央細胞群沒有K+通道的陽性反應。在背面?zhèn)群蠓降诙毎捍嬖谥鳮+通道的陽性細胞，這些細胞直徑為15～30 μm。另外在蕈形體沒有發(fā)現(xiàn)K+通道的陽性反應。在中央神經(jīng)纖維網(wǎng)中有部分靠近圍咽神經(jīng)環(huán)后方的神經(jīng)纖維表現(xiàn)出K+通道免疫陽性（如圖1）。

3 討論

離子通道是一類跨膜糖蛋白，它們在細胞膜上形成的親水性孔道使帶電荷的離子得以進行跨膜轉(zhuǎn)運，是神經(jīng)、肌肉、腺體等許多組織細胞膜上的基本興奮單元，它們能產(chǎn)生和傳導電信號，具有重要的生理功能[11]。

有關鱟的離子通道的研究主要是以美洲鱟的腹部光感受器為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)該光感受器內(nèi)的Ca2+通道是光線依賴的[12]。對于鱟的神經(jīng)系統(tǒng)中的離子通道的分布和特性尚未見報道。

在脊椎動物中Na+通道廣泛存在于可興奮的細胞中，它的開放主要是使細胞去極化，并傳播動作電位。在維持細胞興奮性和正常的生理功能中起重要的作用[13]。在背面中央細胞群的某些細胞發(fā)現(xiàn)Na+通道的存在，這說明Na+通道可能與這些神經(jīng)細胞的興奮有關。在中央神經(jīng)纖維網(wǎng)的神經(jīng)纖維上也發(fā)現(xiàn)了Na+通道，這些Na+通道定位在軸突上，或許該區(qū)域的Na+通道與背面中央細胞群的功能不同。

K+通道是細胞動作電位復極的主要離子電流。它們的變化對動作電位的形狀和時程均有較大影響[14]。該通道是許多藥物的主要靶位點。研究表明K+通道在視神經(jīng)片層和視神經(jīng)髓中有少數(shù)陽性纖維，說明其與視覺信號的傳遞有關。在中間體區(qū)域又發(fā)現(xiàn)了大量的陽性纖維，普遍認為鱟的中間體主要功能是視覺信息的處理和附肢的協(xié)調(diào)運作[15-16]。暗示這些功能與K+通道有關。

我們沒有在中國鱟腦神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)Ca2+通道的陽性細胞或纖維，但是Ca2+通道是廣泛存在于動物的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的[17]。可能是由于鱟腦神經(jīng)節(jié)中的Ca2+通道的亞型不同。由于關于鱟腦神經(jīng)節(jié)離子通道的報道很少，我們只能描述其的分布情況，對離子通道功能的確定還需進一步研究。

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Abstract：The presence and distribution of 3 kinds of ion channels in the brain of Tachypleus tridentatus was investigated by immunocytochemistry.The immunoreactivity-cell （ir-cell） and ir-fiber of Na+ channels and K+ channels were found in the brain of T.tridentatus.Howerer，there was no ir-Ca2+ channels in T.tridentatus brain.Na+ channels located in CBN and DMG.K+ channels located in DMG and DLPG#2.

Key words：Tachypleus tridentatus;ion channels;immunohistochemistry