蔡幸哲 彭林 劉珂芮 劉書亮 李誠 劉愛平

摘要：根據(jù)沙門氏菌噬菌體Lumpael的全基因組序列，預(yù)測該噬菌體裂解酶基因并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;優(yōu)化其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)，并分析噬菌體裂解酶LysLorf22與外膜滲透劑最優(yōu)組合的溶菌效果。結(jié)果表明，裂解酶LysLorf22的相對分子質(zhì)量為1.76×104，等電點(diǎn)為9.14，其較優(yōu)表達(dá)條件為：表達(dá)菌株Escherichia coli BL21，37 ℃誘導(dǎo)4 h。LysLorf22裂解譜較寬，最佳工作濃度為375 nmol/L，在30 min內(nèi)可使氯仿處理的Salmonella Enteritidis ATCC 13076菌懸液OD600下降0.72;375 nmol/L的LysLorf22與0.5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉聯(lián)用對Salmonella Enteritidis ATCC 13076溶菌效果最佳，在2 h內(nèi)可使活菌數(shù)從1.62×109CFU/ml下降至4.31×108CFU/ml。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌;噬菌體;裂解酶;外膜滲透劑

中圖分類號：TS207.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0212-07

Abstract：In this study， the gene encoding endolysin was predicted and analyzed by bioinformatic software based on the genomic sequence of Salmonella bacteriophage Lumpael. Besides， the expression of LysLorf22 in Escherichia coli expression system was optimized， and the bactericidal effect of LysLorf22 combined with outer membrane permeabilizing agents was analyzed. The results showed that the molecular weight of LysLorf22 was 1.76×104， and the isoelectric point was 9.14. The optimal expression condition of LysLorf22 was using expression strain Escherichia coli BL21， induced at 37 ℃ for four hours. LysLorf22 had a broad lytic spectrum， and its optimal working concentration was 375 nmol/L， in which the OD600 of chloroform-treated Salmonella Enteritidis ATCC 13076 could be reduced by 0.72 in 30 minutes. The combination of 375 nmol/L LysLorf22 and 0.5 mmol/L disodium ethylenediamine tetraacetate showed the best lytic effect on Salmonella Enteritidis ATCC 13076， which reduced the viable cells from 1.62×109CFU/ml to 4.31×108CFU/ml in two hours.

Key words：Salmonella;bacteriophage;endolysin;outer membrane permeabilizing agent

沙門氏菌是一種常見的人獸共患病原菌，主要通過蛋、肉等禽類產(chǎn)品感染人類[1]。人感染沙門氏菌后多出現(xiàn)劇烈頭痛、發(fā)熱、急性胃腸炎、嘔吐等癥狀[2-3]。在世界各國各類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌食物中毒占比較高?？股卦谏抽T氏菌的預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用，近年來，由于抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，沙門氏菌多重耐藥菌株也不斷出現(xiàn)。2017年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，沙門氏菌屬細(xì)菌超過50%對氨芐西林產(chǎn)生耐藥性，傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌對環(huán)丙沙星和氯霉素的耐藥力較高[4-6]。沙門氏菌感染的控制面臨極大挑戰(zhàn)，亟待找到一種新型殺菌劑代替抗生素。

噬菌體在自然界中分布廣泛，1958年Jacob等發(fā)現(xiàn)噬菌體編碼的一類蛋白質(zhì)具有裂解細(xì)菌的作用，將其純化后命名為裂解酶[7]。噬菌體裂解酶作為殺菌劑具有高效、特異性較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，并且作為一種蛋白質(zhì)，其理化性質(zhì)易于研究，便于對其進(jìn)行改造優(yōu)化和工業(yè)化生產(chǎn)[8]。但裂解酶的作用效果會受酶濃度、環(huán)境溫度、pH和其他離子的影響，因此應(yīng)用時還需要掌握裂解酶的最適劑量和最佳作用時間，并控制作用條件[9-10]。與抗生素相比，細(xì)菌更難對裂解酶產(chǎn)生抗性，這可能是由于裂解酶的作用位點(diǎn)高度保守，變異幾率小[11]。裂解酶結(jié)構(gòu)一般包括結(jié)合功能域和催化功能域，研究發(fā)現(xiàn)一種裂解酶可能含有1個或多個催化域，這也可能是細(xì)菌難以對裂解酶產(chǎn)生抗性的原因之一[12]。

噬菌體裂解酶能降解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖。革蘭氏陰性菌肽聚糖層較薄，但其肽聚糖層外有較厚的外膜保護(hù)，裂解酶難以直接自外裂解細(xì)菌[13]。目前關(guān)于沙門氏菌噬菌體裂解酶的研究較少。因此探究革蘭氏陰性菌噬菌體裂解酶的生物學(xué)特性，將其與外膜滲透劑（Outer membrane permeabilizing agents，OMP）聯(lián)用或者對裂解酶進(jìn)行修飾以提高其裂解效果是當(dāng)前研究的主要方向[14]。本研究根據(jù)沙門氏菌噬菌體Lumpael的基因組公開序列，利用生物信息學(xué)軟件分析該噬菌體裂解酶，優(yōu)化LysLorf22基因密碼子及其在大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)，并分析裂解酶LysLorf22與OMP最優(yōu)組合對沙門氏菌的溶菌效果，為其在食品、農(nóng)產(chǎn)品安全中的應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌種Pseudomonas aeruginosa ATCC、Escherichia coli ATCC 25922、Staphylococcus aureus ATCC 25923購自美國ATCC，Escherichia coli BL21、Escherichia coli DH5α購自德國Novagen公司，其它菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)王小紅教授和四川農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室惠贈。

1.1.2主要試劑LB肉湯、XLD培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，Triton X-100購自北京吉美生物技術(shù)有限公司，檸檬酸（Citric acid，CA）、蘋果酸（Malic acid，MA）購自上海瑞永生物科技有限公司，3-color Pre-Stained Protein Ladder High Range PM5100購自臺灣SMOBIO公司。

1.1.3主要儀器及設(shè)備JY 92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);Varioskan Flash酶標(biāo)儀、ST 16R冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn);Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Chem DocTM XRS+成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1裂解酶基因LysLorf22的生物信息學(xué)分析從沙門氏菌噬菌體Lumpael的全基因組序列（GenBank登錄號：MK125141.1）查找其裂解酶基因LysLorf22的開放閱讀框，對核苷酸序列進(jìn)行翻譯。利用ExPASy Bioinformatics Resource Portal（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）對裂解酶LysLorf22的相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析，利用NCBI BLAST工具對LysLorf22的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，利用PRABI網(wǎng)站的SOPMA程序 （https：//npsa-prabi.ibcp.fr）對LysLorf22的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，采用NCBI Conserved Domain Database 和InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）對LysLorf22的模塊化結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，利用SignalP 5.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析LysLorf22的信號肽序列，利用TMHMM Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析LysLorf22跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.2裂解酶LysLorf22的表達(dá)

1.2.2.1重組載體pET-28b-LysLorf22的構(gòu)建對裂解酶基因LysLorf22進(jìn)行密碼子優(yōu)化（適于E.coli表達(dá)系統(tǒng)），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成LysLorf22基因（序列3′端加6 x His標(biāo)簽）。按照合成序列，設(shè)計特異性引物并在其5′和3′端分別引入Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)。以LysLorf22基因為模板，擴(kuò)增并純化PCR產(chǎn)物。分別對PCR產(chǎn)物和載體pET-28b進(jìn)行Nco I、Xho I雙酶切，16 ℃連接酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑克隆子測序驗證獲得重組質(zhì)粒pET-28b-LysLorf22。

1.2.2.2裂解酶LysLorf22的表達(dá)條件優(yōu)化為優(yōu)化裂解酶LysLorf22的表達(dá)，用不同的表達(dá)菌株和溫度進(jìn)行試驗。首先，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL21和E.coli C41，并將相應(yīng)轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于5 ml含50 μg/ml卡那霉素（Kanamycin）的LB培養(yǎng)基（LBK）中37 ℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物接種至5 ml新鮮LBK，當(dāng)OD600值約0.6時，將其進(jìn)一步接種于100 ml LBK。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600值達(dá)到約1.0時，加入終濃度0.25 mmol/L異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside， IPTG），分別在16 ℃誘導(dǎo)12 h，30 ℃誘導(dǎo)4 h或37 ℃誘導(dǎo)4 h進(jìn)行裂解酶的表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，以7 000 r/min離心15 min收獲菌體沉淀。以磷酸鹽緩沖液（PBS;50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH 7.5）洗滌沉淀2次，將沉淀重懸于40 ml PBS，并使用冰浴在低于10 ℃的溫度下超聲破碎細(xì)胞（105 W 30 min，開2 s，停2 s），收集上清液（超聲處理后的天然蛋白質(zhì)提取物，NPE）和變性蛋白質(zhì)提取物（超聲處理后沉淀物溶解在8 mol/L尿素中，DPE），取同等體積樣品用于SDS-PAGE分析[15]。

1.2.2.3裂解酶LysLorf22的表達(dá)與純化確認(rèn)裂解酶LysLorf22的較優(yōu)表達(dá)條件后，將其在3 L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)。收集NPE，按照Liu等[16]方法以Ni+-IDA柱（杭州NeuroPeptide生物科學(xué)與技術(shù)公司產(chǎn)品）純化裂解酶LysLorf22，并進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。

1.2.3裂解酶LysLorf22的裂解譜分析參考Mikoulinskaia等[17]的報道，通過濁度法分析裂解酶LysLorf22的裂解譜。將受試菌種接種于130 ml LB肉湯液體培養(yǎng)基中，其中革蘭氏陰性菌在培養(yǎng)至對數(shù)生長期后加入5%（體積分?jǐn)?shù)）的氯仿處理20 min以除去其外膜，以8 000 r/min離心15 min，經(jīng)無菌水多次洗滌后離心收集菌體。將沉淀用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.1% Triton X-100，pH 8.2）重懸，調(diào)節(jié)OD600至0.8～1.0，向200 μl細(xì)菌重懸液中加入50 μl裂解酶，于室溫下作用30 min后檢測OD600，以相同體積Tris-HCl緩沖液（含0.1%Triton X-100）替代裂解酶LysLorf22作為對照。所有試驗重復(fù)3次，根據(jù)裂解率得出裂解酶的裂解譜。裂解率= [（試驗組OD600的減小量-空白組OD600的減小量）/ 菌液初始OD600] ×100%。革蘭氏陽性菌無需用氯仿處理，直接離心收集菌體。

1.2.4裂解酶LysLorf22最佳作用濃度參考Geng等[18]的方法，以裂解效果較好的Salmonella Enteritidis ATCC 13076作為靶標(biāo)菌進(jìn)行裂解酶LysLorf22最佳作用濃度試驗。按照方法1.2.3制得經(jīng)氯仿處理后的細(xì)菌重懸液，將50 μl不同濃度的LysLorf22加入到200 μl細(xì)菌重懸液中（LysLorf22終濃度分別為0.4 nmol/L、2.0 nmol/L、10.0 nmol/L、50.0 nmol/L、250.0 nmol/L、375.0 nmol/L和500.0 nmol/L），在室溫下每隔1 min檢測OD600，共監(jiān)測30 min。以相同體積Tris-HCl緩沖液（含0.1% Triton X-100）替代裂解酶LysLorf22作為對照，所有試驗重復(fù)3次。

1.2.5裂解酶LysLorf22與OMP聯(lián)用的溶菌活性分析

1.2.5.1最佳OMP及其作用濃度的測定參考李萌[13]的方法，通過濁度法確定最佳OMP（EDTA、CA和MA）及其最適濃度。將Salmonella Enteritidis ATCC 13076接種于120 ml LB肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后以8 000 r/min離心15 min，經(jīng)無菌水多次洗滌后離心收集菌體。細(xì)菌沉淀用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（不含0.1% Triton X-100，pH8.2）重懸至OD600為0.8～1.0。將25 μl LysLorf22（終濃度為最佳作用濃度）、25 μl OMP（EDTA終濃度為0.10 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、5.00 mmol/L、10.00 mmol/L、20.00 mmol/L和25.00 mmol/L，CA、MA終濃度為0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、5.0 mmol/L、10.0 mmol/L、20.0 mmol/L和25.0 mmol/L）和200 μl細(xì)菌重懸液混勻，在室溫下靜置[19-21]，每隔30 min檢測OD600，共監(jiān)測2 h。設(shè)置對照，重復(fù)3次。

1.2.5.2最優(yōu)聯(lián)用組合的溶菌計數(shù)按照方法1.2.5.1的方法收集細(xì)菌沉淀并重懸至OD600為0.8～1.0。將100 μl LysLorf22（終濃度為最佳作用濃度）、100 μl OMP（方法1.2.5.1確定的最佳聯(lián)用OMP及其最適濃度）和800 μl細(xì)菌重懸液混勻，在25 ℃靜置2 h，取100 μl混合液梯度稀釋后在XLD培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落計數(shù)。設(shè)置對照，重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1裂解酶基因LysLorf22的生物信息學(xué)分析

根據(jù)沙門氏菌噬菌體Lumpael的基因組序列信息可知其ORF22編碼長度為159個氨基酸的裂解酶（命名為裂解酶LysLorf22）。LysLorf22的相對分子質(zhì)量為1.76×104，等電點(diǎn)為9.14。LysLorf22與Escherichia sp.噬菌體Skarpretter、Klebsiella sp.噬菌體 vB_KpnS_IME279以及Enterobacter bugandensis和Rhodobacter sphaeroides的溶菌酶氨基酸序列相似度為81%～85%。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，LysLorf22主要由α螺旋、無規(guī)則卷曲、β折疊和延伸鏈結(jié)構(gòu)組成，比例分別為43.40%、41.51%、6.92%和8.18%。LysLorf22是8～154位氨基酸與噬菌體λ溶菌酶結(jié)構(gòu)域保守的球狀蛋白質(zhì)酶。LysLorf22不含信號肽序列，也不存在跨膜區(qū)域。

2.2裂解酶LysLorf22的表達(dá)

構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28b-LysLorf22，嘗試不同表達(dá)菌株和表達(dá)溫度組合優(yōu)化裂解酶LysLorf22的表達(dá)。如圖1所示，2種表達(dá)菌株經(jīng)過誘導(dǎo)后均表達(dá)相對分子質(zhì)量約1.70×104的蛋白質(zhì)條帶，且條帶大小符合裂解酶LysLorf22的預(yù)測相對分子質(zhì)量。由目的蛋白質(zhì)條帶深淺可知，較優(yōu)的表達(dá)條件為：表達(dá)菌株E.coli BL21，37 ℃誘導(dǎo)4 h。經(jīng)過大量表達(dá)和純化，獲得了較高純度的LysLorf22（圖2）。

2.3裂解酶LysLorf22的裂解譜

噬菌體裂解酶具有一定的特異性，但是相對于噬菌體，裂解酶的作用又具有一定的廣譜性[22-24]。將19株菌株用于檢測LysLorf22的裂解譜，結(jié)果見表1。LysLorf22基本不能裂解革蘭氏陽性菌Listeria monocytogenes EGDe和Staphylococcus aureus ATCC 25923，但其對受試的經(jīng)氯仿處理的17株革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出裂解活性，宿主譜較寬。受試的12株沙門氏菌中，LysLorf22對Salmonella Enteritidis ATCC 13076的裂解率最高，為79%，故選擇Salmonella Enteritidis ATCC 13076為后續(xù)試驗靶標(biāo)菌。雖然LysLorf22來源于沙門氏菌噬菌體，但是它對E.coli DH5α的裂解率最高（83%），對Salmonella enteritidis ATCC13076的裂解率次之（79%），這可能是由于LysLorf22與Escherichia sp.噬菌體Skarpretter具有較高的同源性。LysLorf22對氯仿預(yù)處理的表達(dá)菌株E.coli BL21具有較強(qiáng)裂解能力，在LysLorf22制備過程中，由于E.coli BL21未經(jīng)氯仿處理且菌株所處環(huán)境缺乏OMP，故幾乎未觀察到表達(dá)菌株E.coli BL21發(fā)酵液變澄清。

2.4裂解酶LysLorf22最佳作用濃度

LysLorf22的最佳作用濃度檢測結(jié)果如圖3所示。LysLorf22濃度為2 nmol/L時即對經(jīng)氯仿處理的宿主菌表現(xiàn)出明顯的裂解效果。裂解酶濃度為250 nmol/L、375 nmol/L和500 nmol/L時裂解效果比較接近。當(dāng)LysLorf22終濃度為375 nmol/L，與宿主菌作用30 min時，OD600下降最多，為0.72，說明噬菌體裂解酶裂解細(xì)菌具有高效性，這與之前的研究結(jié)果[25]一致。

2.5裂解酶LysLorf22與OMP聯(lián)用的溶菌活性

革蘭氏陰性菌由于肽聚糖外膜的保護(hù)作用，裂解酶不能直接自外裂解細(xì)菌，需要OMP協(xié)助裂解酶穿透外膜發(fā)揮作用。本研究將LysLorf22（375 nmol/L）與不同濃度的EDTA、CA和MA聯(lián)用，通過濁度法探究裂解效果，結(jié)果如圖4所示。裂解酶LysLorf22單獨(dú)作用于活菌時，2 h僅使OD600下降0.06，幾乎沒有裂解效果，與Oliveira 等[26]的報道一致。EDTA（終濃度為0.10 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、5.00 mmol/L、10.00 mmol/L、20.00 mmol/L和25.00 mmol/L）單獨(dú)作用于活菌時有一定的抑菌效果，在EDTA作用濃度為0.50 mmol/L時，2 h使OD600下降0.18。LysLorf22與0.1～25.0 mmol/L的EDTA聯(lián)用時能有效裂解宿主菌，當(dāng)EDTA濃度為0.5 mmol/L時，2 h內(nèi)OD600下降最多，為0.47，且在最初30 min內(nèi)作用效果最明顯，OD600下降0.32。CA和MA（終濃度為0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、5.0 mmol/L、10.0 mmol/L、20.0 mmol/L、25.0 mmol/L）單獨(dú)作用于活菌時，抑菌效果不明顯;不同濃度CA和MA（0.1～25.0 mmol/L）與LysLorf22聯(lián)用時的裂解效果優(yōu)于單獨(dú)使用CA和MA，但均弱于EDTA與LysLorf22聯(lián)用效果。

按照上述最優(yōu)裂解組合，使用XLD培養(yǎng)基對其殺菌效果進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果如表2所示。LysLorf22（375 nmol/L）單獨(dú)作用于Salmonella Enteritidis ATCC13076時沒有裂解效果。EDTA（0.5 mmol/L）單獨(dú)作用時效果較小，2 h內(nèi)使細(xì)菌數(shù)量從1.62×109CFU/ml下降至1.14×109CFU/ml，而LysLorf22（375 nmol/L）與EDTA（0.5 mmol/L）聯(lián)用2 h能使細(xì)菌數(shù)量下降至4.31×108CFU/ml，殺菌效率為73.40%。從裂解酶工作濃度和殺菌效果看，LysLorf22與OMP聯(lián)用的活性明顯優(yōu)于Lim等[27]的報道。目前已有將溶菌酶與EDTA聯(lián)用應(yīng)用于食品生產(chǎn)的報道，如Marianna等[28]將溶菌酶、乳酸鏈球菌素和EDTA聯(lián)合應(yīng)用于肉餅殺菌，發(fā)現(xiàn)有明顯的抑制活菌總數(shù)和乳酸菌生長的作用。

3結(jié)論

本研究基于生物信息學(xué)分析，選取pET表達(dá)系統(tǒng)對裂解酶LysLorf22的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得相對分子質(zhì)量為1.76×104的裂解酶LysLorf22。該酶具有高效性和較強(qiáng)的特異性，與外膜滲透劑聯(lián)用時表現(xiàn)出一定程度的溶菌活性，其中LysLorf22與EDTA聯(lián)用對沙門氏菌的殺滅效果最佳，具有較好的控制食品中沙門氏菌污染的潛力。由于LysLorf22對本試驗中的兩株革蘭氏陽性菌沒有明顯的裂解效果，可在與EDTA聯(lián)用的基礎(chǔ)上再與革蘭氏陽性菌噬菌體裂解酶、抗生素聯(lián)用，配置成混合制劑，提高其殺菌廣度?；旌现苿┛蓽p少每種成分的用量，并降低細(xì)菌產(chǎn)生抗性的幾率[29-30]。

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（責(zé)任編輯：張震林）