劉學(xué)峰 張立春 李夢姝 王偉霞 佟桂芝 海龍 李信濤

摘要：本試驗旨在對兩個東北寒區(qū)肉羊新品種群體進(jìn)行FecB基因鑒定和基因多態(tài)性分析。通過提取兩個群體個體外周血基因組DNA樣品，基因組PCR直接測序和HRM法檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個群體中均含有FecB基因，但無論從基因型頻率還是等位基因頻率均存在明顯差異。首先肉毛兼用型群體只含有少量B+基因型個體，B等位基因頻率只有3%左右，且處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。多胎型群體中FecB基因含量則顯著提高，BB和B+基因型頻率依次上升至7%和25%左右，且處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，說明FecB基因在該群體中受到較為強烈的選擇壓力。如需利用兩個群體進(jìn)行兼具產(chǎn)肉性能和高繁殖性能肉羊新品種（系）培育，較為理想的策略是在進(jìn)一步提升兩個群體優(yōu)良特性的前提下，開展兩個群體間雜交。

關(guān)鍵詞：綿羊;FecB基因;基因頻率

中圖分類號： S826 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：2095-9737（2020）03-0004-03

東北寒區(qū)肉羊新品種群是外來品種，主要是高繁殖率小尾寒羊和高產(chǎn)肉性能的德國肉用美利奴羊分別與當(dāng)?shù)貣|北細(xì)毛羊，半細(xì)毛羊雜交，自然選育形成的地方雜交品種群體，具有耐寒、耐粗飼等優(yōu)點，按性能可細(xì)分為肉毛兼用型和多胎型兩種類群[1]。兩類自然雜交群體分布廣泛，群體規(guī)模大，進(jìn)一步可利用兩種類型品種種群優(yōu)勢培育適應(yīng)東北氣候環(huán)境的兼具產(chǎn)肉與多胎性能的肉羊新品種（系）[2，3]。FecB基因是影響綿羊排卵率和繁殖力的主效基因，目前在國內(nèi)外具有高繁殖特性的綿羊品種中均發(fā)現(xiàn)該基因的存在[4-6]。FecB基因作為成熟的高繁殖性狀篩選標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于多胎綿羊品種選育，收到良好的效果[3]。本文以東北寒區(qū)肉羊新品種種群為研究對象，利用HRM技術(shù)對該群體中FecB基因鑒定及多態(tài)性分析，初步證實該群體中存在FecB基因且多胎型群體具有較高基因頻率，為利用FecB標(biāo)記篩選高產(chǎn)肉高繁殖特性地方肉羊新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品采集及主要試劑和儀器

實驗動物為東北寒區(qū)肉羊新品種種群，主要包括肉毛兼用型和多胎型兩種類群，兩者均來自國家肉羊核心育種場黑龍江農(nóng)墾大山羊業(yè)有限公司。血液樣品DNA采集參照試劑盒說明書進(jìn)行。

血基因組DNA制備試劑盒購自Axygen公司;高保真Pfu DNA聚合酶購自Solarbio公司;基因分型試劑盒Light Cycler 480 High Resolution Melting Master購自羅氏公司;實時熒光定量PCR儀為羅氏公司Light Cycler 480 II。

1.2 引物設(shè)計與合成

綿羊FecB基因?qū)嶋H為骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B（BMPR-1B）基因外顯子6上發(fā)生的A746G突變。為檢測該突變，采用Beacon Designer 7.9軟件設(shè)計BMPR-1B基因外顯子6部分序列克隆及HRM檢測引物（BMPR-1B基因登錄號：NC_040257），引物信息見表1。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 BMPR-1B片段擴(kuò)增與FecB基因鑒定

PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2.5 μL，F(xiàn)ecB_C F和R引物（10 mmol/μL）各0.5 μL，DNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，Pfu DNA聚合酶（5.0 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸5 min，12℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。符合要求的PCR產(chǎn)物直接送生物公司測序。

1.4 東北寒區(qū)肉羊新品種群FecB基因型頻率分析

以大山羊業(yè)所采集的肉毛兼用型和多胎型兩種類群體為檢測對象，以所構(gòu)建的FecB基因HRM檢測體系檢測上述品種中FecB基因頻率。HRM反應(yīng)體系為10 μL：High Resolution Melting Master 5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）1.2 μL，F(xiàn)ecB_H正反引物各0.1 μL，模板DNA（20 ng/μL）0.5 μL，ddH2O為3.1 μL。反應(yīng)程序如下：首先95℃預(yù)變性10 min;隨后擴(kuò)增45個循環(huán)，每個循環(huán)溫度依次為94℃保持15 s，退火溫度62℃保持30 s;擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行HRM分型，分型條件為：95℃保持1 min，40℃保持1 min，65℃保持1 s;從65℃開始按25次/℃的頻率收集熒光信號;最后降溫至40℃保持40 s。檢測結(jié)果用自帶Gene Scanning軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

基因頻率分析采用GENEPOP 4.7軟件，Hardy-weinberg平衡檢驗采用卡方檢驗進(jìn)行。

2 實驗結(jié)果

2.1 東北寒區(qū)肉羊新品種群FecB基因檢測與驗證

首先以肉毛兼用型和多胎型兩種類群體典型個體基因組為模板，使用高保真酶基因組PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，直接測序法鑒定東北寒區(qū)肉羊新品種群中是否含有FecB基因，基因組PCR電泳結(jié)果顯示，兩個群體典型個體BMPR-1B基因外顯子6擴(kuò)增片段特異，大小符合預(yù)期（圖1），將基因組PCR產(chǎn)物直接測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多胎型個體中擴(kuò)增片段存在A746G突變（圖2），按慣例將等位基因為A的純合個體命名為++，將等位基因G的純合個體命名為BB，雜合個體命名為B+。

2.2 東北寒區(qū)肉羊新品種群FecB基因型頻率分析

基因組PCR直接測序法證實多胎型東北寒區(qū)肉羊新品種群存在FecB基因，為進(jìn)一步檢驗該群體中FecB基因的多態(tài)性，進(jìn)一步以已建立的HRM檢驗方法，對兩種類型核心群共計342頭母羊進(jìn)行了FecB基因檢驗。Gene Scanning分析發(fā)現(xiàn)FecB基因歸一化溫度轉(zhuǎn)移差異圖與HRM方法建立時的結(jié)果完全一致（圖3），進(jìn)一步證明HRM方法在檢測FecB基因的可靠性。接下來使用Genepop軟件對兩個群體FecB基因型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩群體間FecB基因型頻率存在明顯差異（表2），表現(xiàn)為肉毛兼用型群體并不存在BB純合性存在，B+基因型頻率較為稀少（6.11%），絕大部分為++基因型，等位基因型頻率也證實此結(jié)果，說明肉毛兼用型群體缺乏FecB基因，如在群體內(nèi)部應(yīng)用FecB基因進(jìn)行多胎性狀篩選較為困難。相較肉毛兼用型群體，多胎型群體中盡管++基因型仍然處于優(yōu)勢地位，但無論FecB基因型頻率還是等位基因頻率均顯著提升，其中純合BB基因型頻率已上升至7.11%，B+基因型頻率則上升至25.11%（表2）?？ǚ綑z驗檢測上述兩個群體FecB基因型是否處于Hardy-weinberg平衡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉毛兼用型處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，而多胎型群體則處于Hardy-weinberg不平衡狀態(tài)。說明就FecB基因或繁殖性狀來說，多胎型群體處于較強的人工選擇狀態(tài)。

3 討論

目前我國綿羊品種培育進(jìn)入新的發(fā)展時期，品種選育目標(biāo)已不局限于單一性狀的提高，可借助成熟分子標(biāo)記實現(xiàn)多優(yōu)良性狀在同一群體內(nèi)聚合。目前肉羊育種中較為流行的做法是利用國外肉羊品種改良我國地方綿羊產(chǎn)肉性能，同時希望導(dǎo)入高繁殖基因?qū)崿F(xiàn)高產(chǎn)肉性能和高繁殖性能在培育品種（系）中實現(xiàn)聚合[7]。FecB基因作為繁殖性狀主效基因已在綿羊品種選育中得到廣泛應(yīng)用且效果顯著[8]。利用所建立的實驗方法對來自國家肉羊核心育種場黑龍江農(nóng)墾大山羊業(yè)有限公司的兩種類型東北寒區(qū)肉羊新品種群（肉毛兼用型和多胎型）進(jìn)行檢驗，為基于兩種類型肉羊培育新型肉羊品種（系）奠定基礎(chǔ)。

黑龍江農(nóng)墾大山羊業(yè)有限公司原隸屬于農(nóng)科大山種羊場，所擁有的兩種類型群體具有明顯生產(chǎn)性能差異。肉毛兼用型產(chǎn)肉為主，兼具產(chǎn)毛性能。多胎型多胎性能突出，兼具一定的產(chǎn)肉性能。兩者生產(chǎn)性能差異是由于雜交親本的差異，肉毛兼用型是德肉美與本地東北細(xì)毛羊或半細(xì)毛羊雜交而成，而多態(tài)型群體親本為德肉美和本地小尾寒羊雜交而成。其選育目標(biāo)和育種方向存在一定差異，主要表現(xiàn)為肉毛兼用型主要選育目標(biāo)為肉用性能，兼顧毛用性能，而多胎型則以多胎性狀為主，產(chǎn)肉性能為輔?；驕y序結(jié)果也證實，兩群體中存在FecB基因（圖1和2），提示可用FecB基因進(jìn)行高繁殖性狀的篩選。但兩個群體FecB基因型頻率存在較大差異，主要表現(xiàn)為多胎型BB基因型和B等位基因頻率明顯升高，基于前期研究結(jié)果證實純種德肉美羊中不大可能存在FecB基因，因此有理由相信多胎型群體FecB基因是由其母本-小尾寒羊所提供的[6]。鑒于兩個群體在選育目標(biāo)和策略存在一定差異，肉毛兼用型更多關(guān)注產(chǎn)肉和毛用性狀，多繁殖性狀并未更多人為干預(yù)，相反多胎型群體則在產(chǎn)羔性狀上施加較強的選擇壓力，F(xiàn)ecB基因Hardy-weinberg檢驗也可證明此觀點，從而也證實在多胎型群體中FecB基因?qū)Χ嗵ケ硇偷呢暙I(xiàn)率較大。但從本研究結(jié)果來看，從單一群體導(dǎo)入肉羊外血并不能在短時間內(nèi)實現(xiàn)，其一為肉毛兼用型群體FecB基因型頻率過低，不太可能在短時間內(nèi)提升繁殖性能，而多胎型群體產(chǎn)肉性能又達(dá)不到育種目標(biāo)，導(dǎo)入不含有FecB基因的肉羊外血將會稀釋原本頻率就不高的FecB基因。因此，較為合理的選育策略是首先增大選擇壓力，提升兩個群體自身生產(chǎn)性能，最后在進(jìn)行兩個群體間雜交，最終實現(xiàn)產(chǎn)肉性能和繁殖性能的聚合。

4 結(jié)論

本試驗采用直接測序和HRM技術(shù)對黑龍江農(nóng)墾大山羊業(yè)有限公司具有鮮明生產(chǎn)特性的兩個東北寒區(qū)肉羊新品種群進(jìn)行FecB基因鑒定和多態(tài)性分析。結(jié)果證實兩個群體均含有FecB基因，但基因型頻率存在較大差異。如想利用兩個群體進(jìn)行兼具產(chǎn)肉性能和高繁殖性能肉羊新品種（系）培育，較為理想的策略是在進(jìn)一步提升兩個群體優(yōu)良特性的前提下，開展兩個群體間雜交。

參考文獻(xiàn)：

[1] 門宇新. 對黑龍江省肉羊良種繁育體系建設(shè)的幾點看法[J]. 黑龍江動物繁殖， 2017， 25（01）： 60-62.

[2] 劉俊石， 段永霞. 雜交培育多胎性肉羊新品種的選育[J]. 中國畜牧業(yè)， 2018（24）： 62-63.

[3] 曹陽， 金海國， 張立春， 等. FecB基因?qū)Χ嗵テ废稻d羊培育的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 41（03）： 77-80.

[4] Hua G-H， Yang L-G. A review of research progress of FecB gene in Chinese breeds of sheep[J]. Animal Reproduction Science， 2009， 116（1-2）： 1-9.

[5] 于洋， 梁小軍， 馬吉鋒， 等. 灘湖F2代FecB基因的多態(tài)性檢測[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2018（04）： 44-45.

[6] 王根林， 毛鑫智， Davis G H， 等. DNA分析發(fā)現(xiàn)我國湖羊和小尾寒羊存在Booroola （FecB）多胎基因[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2003（01）： 104-106.

[7] 張云生， 靳勇. 新疆建立綿羊多胎經(jīng)濟(jì)性狀分子改良體系的研究分析[J]. 草食家畜， 2017（03）： 9-18.

[8] 郭立宏. 利用RFLP標(biāo)記檢測德肉美羊多胎（FecB）基因型的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2016（09）： 115-117.