金領微 潘 敏 葉菡洋 陳 琰 葉白如 鄭 育 潘殊方 施 珍 張 靜

腎缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion，I/R)是急性腎衰竭的常見原因，與住院時間長、病死率高有關，在腎移植、心血管手術等許多臨床環(huán)境中不可避免[1]。腎I/R損傷是一個復雜的病理生理過程，其機制是多因素和相互依賴的，其中包括氧化應激損傷和炎性反應。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)應激是過度I/R狀態(tài)的結(jié)果之一，研究表明ER應激可激活自噬[2,3]。自噬作用是一個保守的分解代謝過程，主要功能是降解損傷、錯誤折疊或聚集蛋白質(zhì)和細胞內(nèi)細胞器。此外，ROS被發(fā)現(xiàn)在自噬過程中發(fā)揮重要作用，這表明氧化應激和自噬密切相關[4]。同樣，炎癥過程被認為是腎I/R損傷的關鍵機制， ROS是炎性反應中的重要介質(zhì)[5]。故認為ROS過度產(chǎn)生、炎性反應、ER應激和自噬之間存在密切聯(lián)系。

二甲雙胍作為經(jīng)典降糖藥，對腎臟具有保護作用，它通過激活AMPK通路上調(diào)抗氧化的硫氧還蛋白的表達發(fā)揮其抗氧化活性，從而減弱ROS的過度形成[6]。此外，它還可抑制多種代謝性疾病相關的炎性因子[7]。二甲雙胍預處理減輕I/R損傷的有效性已有報道[1]。然而，其對腎I/R中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激自噬和炎性反應的影響尚不清楚。因此，本研究著重闡述二甲雙胍和大鼠腎I/R后氧化應激、炎癥、ER應激和自噬的關系。

材料與方法

1.主要藥物與試劑:二甲雙胍購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及蛋白試劑盒購自南京建成科技有限公司；細胞質(zhì)細胞核蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；GRP 78(#3183)、CHOP(#2895)、p-Eif2-α(#9721)、Beclin-1(#3738)、β-actin(#5125)抗體購自美國Cell Signaling 公司；XBP-1(sc-8015)購自美國Santa Cruz公司；ATF-6α(SM7007P)購自美國Acris Antibodies公司；LAMP-2(ab13524)購自美國Abcam公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。

2.動物模型制備及分組：健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250克，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2017-0005]。動物腹腔注射戊巴比妥麻醉(5%)，腎缺血再灌注操作按Mahfoudh-Boussaid等[8]所述的方法進行，動物進行常規(guī)剖腹手術，并用平滑的血管鉗鉗住雙側(cè)腎蒂，導致局部缺血。將大鼠隨機分為3組(每組6只),即假手術組(Sham)：腎蒂切開，但血管未發(fā)生閉塞；缺血再灌注組(I/R)：大鼠腎臟缺血1h，再灌注2h；二甲雙胍組(metformin)：對動物的處置與I/R組相同，但在模型建立前腹腔注射二甲雙胍0.125mg/(kg·d)，共14天，Sham組和I/R組給予等容量0.9%氯化鈉注射液。實驗結(jié)束后對大鼠實施安樂死，采集大鼠組織和血液樣本。

3.血漿肌酐和乳酸脫氫酶活性測定：采用AU5821全自動生化分析儀(美國Beckman Coulter有限公司)測定血漿樣品中肌酐(Cr)和乳酸脫氫酶(LDH)含量。

4.抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化評估:根據(jù)說明書采用各試劑盒進行檢測，通過UV759紫外可見分光度計(上海圣科儀器設備有限公司)分別測定大鼠腎臟組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量。

5.蛋白印跡分析:按細胞核蛋白抽提試劑盒說明操作，提取腎組織細胞核蛋白，蛋白濃度采用BCA 法測定，加入上樣緩沖液煮沸 5min，經(jīng)12% SDS-PAGE 凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉 2h，與一抗(GRP 78、CHOP、p-Eif2-α、Beclin-1、β-actin、XBP-1、ATF-6α、LAMP-2)1∶1000 在 4℃孵育過夜，TBST 洗膜，二抗(羊抗兔，1∶5000)室溫孵育 1h，洗膜，ECL 化學發(fā)光顯影。Image 6.0 軟件量化蛋白質(zhì)水平。

6.實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR):采用TRIzol試劑按說明書從腎組織中提取總RNA，分離RNA進行定量及反轉(zhuǎn)錄。在循環(huán)的實時PCR系統(tǒng)中對白介素(IL)1β、IL-6、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達進行RT-PCR分析。β-actin作為內(nèi)參。引物序列如下：IL-1β, F：5′-CTCTGACAGGCAACCACTTAC-3′， R:5′-GTCCAAATTCAATTCATCCC-3′; IL-6, F: 5′-TTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′, R: 5′-ACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3′; MCP-1, F: 5′-TTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′, R: 5′-ACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3′; β-actin, F: 5′-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′, R: 5′- GCTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′。

7.腎組織學：腎活檢在10%的甲醛中固定，石蠟包埋，5μm切片，標準蘇木精-伊紅(HE)進行染色。由經(jīng)驗豐富的腎臟病理醫(yī)生在不知曉實驗組的情況下進行組織學評估(每個腎取10個切片)，使用徠卡光鏡觀察，放大倍數(shù)400倍。采用Jablonski半定量評分(0～4分)評價腎小管損傷程度[9]。

結(jié) 果

1.二甲雙胍預處理對腎臟損傷及功能的影響:I/R組大鼠腎臟血漿肌酐濃度較假手術組明顯升高，而二甲雙胍治療可以緩解肌酐水平的升高(P<0.05)。腎損傷的結(jié)果與肌酐濃度一致，I/R組LDH明顯高于假手術組(P<0.05)。與I/R組比較，二甲雙胍預處理可顯著降低血漿中LDH的活性，詳見圖1。

圖1 3組血漿肌酐濃度(A)及乳酸脫氫酶活性(B)與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

2.二甲雙胍預處理對抗氧化酶活性和氧化應激的影響：二甲雙胍預處理對維持抗氧化酶活性和腎組織氧化應激程度的影響如圖2所示，與假手術組比較，I/R組大鼠腎臟SOD、CAT、GPX活性和GSH含量較假手術組明顯下降，MDA濃度明顯增加 (P<0.05)，而二甲雙胍組顯著逆轉(zhuǎn)了所有這些結(jié)果(P<0.05)。

3.二甲雙胍預處理阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激：免疫印跡分析二甲雙胍預處理對ER應激的影響如圖3所示， GRP78、ATF-6α、p-eIF-2α、XPB-1和CHOP在I/R組水平高于假手術組(P<0.05)，而與I/R大鼠比較，二甲雙胍處理的大鼠蛋白的表達均明顯減弱(P<0.05)。

圖2 腎組織中SOD(A)、CAT(B)、GPX(C)、GSH(D)和MDA(E)水平與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

圖3 免疫蛋白印跡分析GRP 78、ATF-6、p-eIF-2α、XBP-1、CHOP的蛋白表達水平β-actin為內(nèi)參；與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

4.二甲雙胍預處理阻止自噬作用：自噬相關蛋白Beclin-1和LAMP-2來評估二甲雙胍對自噬通量的影響，如圖4所示，大鼠I/R后Beclin-1和LAMP-2的蛋白表達均升高(P<0.05)。與I/R組比較，二甲雙胍處理的大鼠蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

圖4 免疫蛋白印跡分析Beclin-1和LAMP-2的蛋白表達水平β-actin為內(nèi)參；與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P <0.05

5.二甲雙胍預處理對炎癥的影響：對大鼠腎臟組織進行實時定量PCR以確定二甲雙胍預處理對炎性反應的影響(圖5)，再灌注24h后，與假手術組比較，I/R大幅度增加炎性因子 (IL-1β、IL-6和MCP-1)的mRNA水平(P<0.05)。與I/R組比較，二甲雙胍處理能夠顯著降低再灌注24h后的促炎性因子的表達(P<0.05)。

圖5 RT-PCR分析 IL-1β(A)、IL-6(B)和MCP-1(C)基因表達水平與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

6.二甲雙胍處理后組織學改變：腎臟損傷的組織學特征證實了生化指標的變化(圖6)，在I/R組觀察到嚴重的損傷，包括刷狀緣缺失、核凝結(jié)、細胞腫脹。與假手術組比較，I/R術后出現(xiàn)腫脹、細胞核丟失和出血。與I/R組比較，二甲雙胍預處理顯示腎損傷的組織學特征明顯減弱，腎損傷評分也顯著降低(P<0.05)。

圖6 腎臟組織的組織學照片(HE，×400)(A)及采用Jablonski評分評價腎損傷程度(B)藍色箭頭所指為刷狀緣缺失，紅色箭頭所指為管狀梗阻，H為出血，L為細胞核丟失；與Sham組比較，*P <0.05；與I/R組比較，#P <0.05

討 論

在I/R損傷下，二甲雙胍對腎臟組織的有益作用已得到充分證明[1, 6, 7]。然而，其對腎I/R損傷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自噬信號通路的影響尚未闡明。因此，本研究旨在評估二甲雙胍預處理對腎I/R損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以降低氧化應激，同時抑制炎性因子表達。同樣，這些機制之間的密切關系可能是由活性氧的過度形成所引起的，故二甲雙胍的保護作用可能通過清除活性氧發(fā)揮抗氧化功能。

本研究證實了關于腎I/R在功能和結(jié)構改變方面的有害后果[8]。與假手術組比較，腎I/R結(jié)果顯著增加了血漿肌酐濃度和LDH活性，而二甲雙胍可顯著降低I/R大鼠的上述指標。MDA水平也被稱為脂質(zhì)過氧化標志物，在I/R后增加[10]。與假手術組比較，二甲雙胍處理后細胞脂質(zhì)氧化顯著降低。這可以穩(wěn)定細胞質(zhì)膜和線粒體膜，因此有助于降低LDH釋放所出現(xiàn)的細胞溶解。這種細胞壞死的直接后果是維持腎臟結(jié)構，特別是壞死細胞，腎小管充血和出血更少。既然自由基釋放或增加是細胞結(jié)構氧化和降解的主要原因，可以認為二甲雙胍的有益作用與抑制活性氧生成過多的作用密切相關。SOD代表機體清除自由基的能力，負責清除機體釋放自由基，SOD和CAT、GSH在正常生理狀態(tài)下能將體內(nèi)生成的氧自由基逐步催化還原，生成對人體無害的水和氧[11，12]。本研究證明了二甲雙胍處理通過增加抗氧化酶SOD、CAT、GPX的活性和GSH的水平來刺激細胞抵抗自由基，是一種抗氧化應激的保護劑。這些結(jié)果表明，二甲雙胍的外源性供應可以增強腎缺血大鼠的抗氧化能力。

氧化應激通過破壞蛋白折疊通路和上調(diào)錯誤折疊蛋白的產(chǎn)生而加劇ER應激[13]。另一方面，ER應激可通過ROS積累促進氧化應激[14]。研究表明腎I/R與GRP78、p-PERK、ATF4、ATF6、XBP-1、CHOP水平升高有關[8, 15]。本研究結(jié)果表明，腎I/R誘導GRP78、ATF-6、 p-eIF-2α、XPB-1水平升高。此外，通過定量CHOP水平來評估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，發(fā)現(xiàn)I/R后CHOP水平也增加了，而二甲雙胍能夠抵消以上ER應激的上調(diào)。與此一致，研究表明二甲雙胍可降低小鼠肝組織中GRP78、IRE-1α表達，提示二甲雙胍可改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[16]。

自噬作用或稱細胞自消化，是基于雙膜泡(自噬體)的形成，它吞噬受損的成分并與溶酶體融合進行降解。大量研究表明ER應激激活自噬。Andriana等[17]研究表明,XPB-1和Ire1α的下游轉(zhuǎn)錄因子可通過轉(zhuǎn)錄激活Beclin-1誘導自噬作用，證實了本研究中XPB-1和 Beclin-1的高表達。同時，抑制PERK也顯著降低了c-myc誘導的人淋巴瘤細胞自噬作用[3]。本研究通過量化自噬體形成指標Beclin-1和LAMP-2(自噬體-溶酶體融合所需的蛋白)來評估自噬的動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)I/R后它們的水平顯著升高。此外，筆者的結(jié)果與Wu等[18]的研究結(jié)果一致，顯示缺血腎中Beclin-1和LAMP-2蛋白水平升高。既往研究表明ER應激誘導自噬的保護作用[2]。然而，當自噬作用過度時，筆者發(fā)現(xiàn)它是有害的，并促進細胞死亡。此外，Ding等[19]研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬作用可抑制ER應激誘導的細胞死亡。而本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可顯著降低自噬的過度激活。

本研究也證實了二甲雙胍對炎癥過程的影響，二甲雙胍減少腎I/R后促炎細胞因子IL-1β、 IL-6、MCP-1的分泌。再灌注過程中，活化的浸潤細胞進入受損腎組織，釋放大量促炎細胞因子。實驗結(jié)果表明，在缺血再灌注2h后，促炎細胞因子IL-1β、IL-6和MCP-1的分泌處于低水平，但再灌注24h后顯著增加。炎性細胞因子的產(chǎn)生，在某種程度上可能有助于ER應激通過炎性復合物NLRP3 刺激IL1-β釋放[20]。有報道稱CHOP與炎性反應相關，故ER應激可能會引發(fā)炎癥。反過來，炎癥導致ROS的過度產(chǎn)生，有研究表明，自噬通過促進炎性復合物降解并通過自噬體隔離它們來抑制炎性反應。

綜上所述，二甲雙胍能夠有效保護腎臟免受缺血再灌注(I/R)誘導的損害，其對調(diào)節(jié)氧化應激、ER應激通路和自噬過程具有潛在作用。此外，二甲雙胍還具有抑制細胞炎性損傷的作用。