楊杰智 徐 倩 楊明月 呂紅瓊 黃 靜

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率和病死率在我國位居第3位，僅次于肺癌和肝癌[1]。胃癌的早期癥狀并不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，手術(shù)治療以及放療、化療的效果并不理想，臨床迫切需要基因靶向治療、免疫療法等新興治療方法[2]。人類細(xì)胞長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200nt的內(nèi)源性單鏈RNA，本身不具有編碼蛋白的功能[3]。lncRNA可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)水平調(diào)控基因的表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的活動密切相關(guān), 在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4, 5]。越來越多的lncRNA被歸類為抑癌基因或癌基因[6]。BACE2-IT1是一種長度為382nt的lncRNA，其在細(xì)胞特別是腫瘤細(xì)胞中的作用未見報(bào)道。本研究通過檢測BACE2-IT1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)，并以胃癌細(xì)胞株為研究對象進(jìn)行體外研究, 探討B(tài)ACE2-IT1對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其可能的分子機(jī)制, 為lncRNA的分子靶向治療提供一定理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料： 收集2017年1月～2018年9月筆者醫(yī)院行手術(shù)切除治療的胃癌臨床標(biāo)本26例，包括胃癌組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣超過5cm)，術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)生確認(rèn)無誤，研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn), 參與患者均簽署知情同意。載有BACE2-IT1的慢病毒和空載慢病毒由上海漢恒科技有限公司合成；人胃癌細(xì)胞株MGC803、BGC-823、SGC7901、HS-746T、AGS和永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清均購自美國Gibco公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購自大連寶生物試劑公司；CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Costar公司；抗體(HACE1、Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC、α-Tubulin)、Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司； qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染：人胃癌細(xì)胞株MGC803、BGC-823、SGC7901、AGS和永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，胃癌細(xì)胞株HS-746T復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。收集對數(shù)期生長的BGC-823細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞板。待細(xì)胞融合度為60%，以感染復(fù)數(shù)(MOI)=40將慢病毒顆粒液體感染BGC-823細(xì)胞，加10μmol/ml聚凝胺以增加感染效率，24h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換新鮮培養(yǎng)基。

3.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測BACE2-IT1和HACE1 mRNA的表達(dá)：Trizol法提取胃癌組織和胃癌細(xì)胞株總RNA，檢測RNA濃度和純度后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行qPCR檢測。qPCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性8min, 95℃變性1min, 56℃退火30s, 72℃延伸1min, 共35個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行處理，以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測組織或細(xì)胞中BACE2-IT1和HACE1 mRNA的相對表達(dá)量。GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT- 3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；BACE2-IT1上游引物：5′-GCTAGTGCTCAGTTTGGTCTGA-3′，下游引物：5′-GCTCCTTAGATCAGGTATCCAGAG-3′；HACE1上游引物：5′-AGTTGCCCGAGGATAATGAAAC-3′，下游引物：5′-TCCACCGATCCACAATTTGCT-3′。

4.CCK-8檢測感染后BGC-823細(xì)胞的增殖能力：將感染后的BGC-823細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組平行4個(gè)孔。CCK-8檢測方法：每孔加5mg/ml的CCK-8試劑10μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，每孔加150μl二甲基亞砜，采用SpectraMax plus384型全波長酶標(biāo)儀檢測每孔在波長450nm處的吸光度(A)值。連續(xù)檢測5天，繪制細(xì)胞生長曲線。

5.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測感染后BGC-823細(xì)胞的侵襲能力：采用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，平鋪至Transwell小室上室內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)凝固1h。將感染后的BGC-823細(xì)胞消化、離心收集，采用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/毫升。均勻加入200μl細(xì)胞懸液至Transwell小室上室，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基600μl至Transwell小室下室，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出Transwell小室上室，棉簽擦去上室未穿膜的細(xì)胞, PBS溶液漂洗，采用多聚甲醛固定25min，吸去固定液，采用0.1%的結(jié)晶紫染液染色25min，PBS溶液漂洗3次,晾干后在倒置顯微鏡下, 每組隨機(jī)選4個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并取平均值。

6．蛋白質(zhì)印跡法(Western blot法)：將感染后的BGC-823細(xì)胞采用細(xì)胞裂解液裂解并提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒分析蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1h。加入一抗HACE1(1∶1000稀釋)、Wnt(1∶2000稀釋)、β-catenin(1∶500稀釋)、GSK-3β(1∶2000稀釋)、APC(1∶2000稀釋)、α-Tubulin(1∶3000稀釋)， 4℃下孵育過夜，加入二抗在室溫下孵育1h。滴加ECL顯影液至條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)顯影并拍照。

結(jié) 果

1.BACE2-IT1在胃癌組織中的表達(dá)：qPCR結(jié)果顯示BACE2-IT1在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分別為1.34 ± 0.35和5.66 ± 1.09，BACE2-IT1在胃癌組織中低表達(dá)，詳見圖1。

圖1 BACE2-IT1在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.BACE2-IT1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)：qPCR結(jié)果顯示BACE2-IT1在MGC803、BGC-823、SGC7901、AGS細(xì)胞株和永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中的表達(dá)量分別為0.51±0.05、0.10±0.01、0.81±0.03、0.69±0.06、0.35±0.03和1.00±0.04，與永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1比較，BACE2-IT1在胃癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。BACE2-IT1在BGC-823細(xì)胞表達(dá)降低最明顯(P<0.01)，故以BGC-823細(xì)胞為對象進(jìn)行研究，詳見圖2。

圖2 BACE2-IT1在永生化胃黏膜上皮細(xì)胞株和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)與GES-1細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.qPCR檢測感染后BGC-823細(xì)胞中BACE2-IT1的表達(dá)：qPCR結(jié)果顯示，對照組和實(shí)驗(yàn)組胃癌BGC-823細(xì)胞中BACE2-IT1的表達(dá)分別為1.07±0.23和8.08±0.63，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證明外源性BACE2-IT1在BGC-823細(xì)胞中成功表達(dá)。

4．BACE2-IT1對胃癌BGC-823細(xì)胞增殖能力的影響：采用CCK-8法檢測BACE2-IT1過表達(dá)對 BGC-823細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組BGC-823細(xì)胞從第2天開始，細(xì)胞增殖能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 BACE2-IT1過表達(dá)對胃癌BGC-823細(xì)胞增殖能力的影響與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.BACE2-IT1對胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響：采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測BACE2-IT1過表達(dá)對 BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響，對照組和實(shí)驗(yàn)組BGC-823穿膜細(xì)胞數(shù)分別為87.82±9.57和36.65±5.78，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證明BACE2-IT1過表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的侵襲能力，詳見圖4。

圖4 BACE2-IT1過表達(dá)對胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響

6.qPCR檢測感染后BGC-823細(xì)胞中HACE1 mRNA的表達(dá)：qPCR結(jié)果顯示，對照組和實(shí)驗(yàn)組胃癌BGC-823細(xì)胞中HACE1 mRNA的表達(dá)分別為1.01±0.09和4.31±0.52，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證明BACE2-IT1過表達(dá)可上調(diào)BGC-823細(xì)胞中HACE1 mRNA的表達(dá)。

7.BACE2-IT1過表達(dá)對胃癌BGC-823細(xì)胞HACE1蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)的影響：Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的 HACE1蛋白表達(dá)上調(diào)，而Wnt/β-catenin信號通路蛋白Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC表達(dá)下調(diào)，詳見圖5。

圖5 BACE2-IT1過表達(dá)對胃癌BGC-823細(xì)胞中HACE1蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)的影響

討 論

胃癌在我國的發(fā)生率和病死率呈迅速上升趨勢，嚴(yán)重威脅人群健康，分子靶向治療研究是胃癌治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[7]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類具有組織特異性的非編碼RNA，大多數(shù)lncRNA由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成[8]。lncRNA可參與染色質(zhì)核內(nèi)運(yùn)輸以及原癌基因活化等重要過程，在多種癌癥如前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等中發(fā)揮癌基因或者抑癌基因的角色，lncRNA具有成為可靠生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力[9～12]。近年來的大量研究表明，lncRNA的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。lncRNA如ZFPM2-AS1、MAP3K20、TP73-AS1、GACAT3在胃癌組織和細(xì)胞株中過表達(dá)，與胃癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，促進(jìn)胃癌的惡性生物性行為[14～16]。lncRNA如LINC00675在胃癌組織和細(xì)胞株中低表達(dá)，參與抑制胃癌的增殖、遷移和侵襲，與胃癌的病理特征和預(yù)后等密切相關(guān)[17]。BACE2-IT1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，BACE2-IT1在胃癌中的表達(dá)模式、作用機(jī)制尚不清楚。

本研究檢測BACE2-IT1在胃癌中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，BACE2-IT1在胃癌組織和細(xì)胞株中明顯低表達(dá)，提示BACE2-IT1可能在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究進(jìn)一步通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BACE2-IT1過表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖能力和侵襲能力，進(jìn)一步提示BACE2-IT1在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用。HECT家族E3泛素連接酶1(HACE1)是E3泛素接酶HECT家族成員之一，位于6q21染色體[18]。HACE1在結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中低表達(dá)，HACE1過表達(dá)可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，是一種潛在的抑癌基因[18]。有研究表明，與癌旁組織比較，胃癌組織中HACE1的表達(dá)顯著降低；HACE1的表達(dá)水平與胃癌的病理分級、分期呈負(fù)相關(guān)；HACE1過表達(dá)在體內(nèi)和體外均可明顯抑制胃癌的生長和轉(zhuǎn)移[19]。本研究通過qPCR和Western blot法驗(yàn)證，BACE2-IT1在胃癌細(xì)胞BGC-823中過表達(dá)后，HACE1基因的表達(dá)明顯上調(diào)，表明BACE2-IT1可促進(jìn)HACE1基因的表達(dá)。HACE1主要通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，干擾腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[19]。Western blot法檢測結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞BGC-823中HACE1基因表達(dá)上調(diào)后，Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC等Wnt/β-catenin信號通路蛋白的表達(dá)明顯降低，Wnt/β-catenin信號通路的活化被抑制。

綜上所述，本研究驗(yàn)證BACE2-IT1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)減少，BACE2-IT1過表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其分子機(jī)制可能是BACE2-IT1正調(diào)控對HACE1的表達(dá)并抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，為探索胃癌的發(fā)生機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)分子治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。BACE2-IT1調(diào)控HACE1基因表達(dá)的作用機(jī)制仍不明確，是今后研究的重點(diǎn)。