張娟，杜武，劉宏明

(1.淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086；2.淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博255036)

鳶都感冒顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第六冊，是純中藥制劑，由忍冬藤、板藍(lán)根、前胡、葛根、桔梗、甘草、牛蒡子(炒)、薄荷腦八味中藥材構(gòu)成，功效為清熱解表，宣肺止咳，臨床用于治療風(fēng)熱感冒，頭疼身痛，發(fā)熱惡寒，咽痛咳嗽[1]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無含量測定項(xiàng)目，為了更好地控制制劑質(zhì)量，本文建立了高效液相色譜法-二極管陣列檢測器同時(shí)測定鳶都感冒顆粒中綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素和牛蒡苷含量的方法，本法靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以為鳶都感冒顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-2030C型高效液相色譜儀(DAD檢測器)；KS-300E超聲波清洗器(寧波科生儀器廠,功率為300 W，頻率為40 kHz)；Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；綠原酸(中檢院，批號:110753-201817，96.8%)；葛根素對照品(中檢院，批號:110752-201615，95.4%)；3′-甲氧基葛根素(ANPEL，批號：T3530010，94.0%)；牛蒡苷對照品(中檢院，批號:110819-201611，95.9%)。鳶都感冒顆粒(批號：170202、121205、181105)均為市購。水為超純水，乙腈為色譜純，磷酸、甲醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL·min-1；流動相： 0.05 %磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫0～15 min，95% A；15～20 min，95% A→92% A；20～30 min，92% A；30～45 min，92% A→89% A；45～58 min，89% A→88% A；58～65 min，88% A→82% A；65～75 min，82% A→75% A；75～90 min，75% A→70% A；柱溫40 ℃；檢測波長327 nm(15～30 min，檢測綠原酸)、250 nm(30～45 min，檢測葛根素和3′-甲氧基葛根素)、278 nm(75～85 min，檢測牛蒡苷)；供試品和對照品進(jìn)樣量均為10 μL。在此色譜條件下，4種組分理論板數(shù)均大于5 000，相鄰兩色譜峰分離度均大于1.5，見圖1～ 7。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取本品1袋，研細(xì)，精密稱定細(xì)粉2 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取20 mL甲醇加入錐形瓶中，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放至室溫，再稱定，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 陰性樣品溶液 根據(jù)鳶都感冒顆粒處方，模擬其制備工藝，制備了不含忍冬藤、葛根、牛蒡子(炒)的陰性樣品，依照“2.1.1”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.2.3 對照品溶液 對照品貯備液：精密稱取綠原酸對照品10.13 mg，置入25 mL量瓶，加甲醇適量，超聲使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸對照品貯備液(0.392 2 g·L-1)。同法制成葛根素對照品貯備液(1.302 2 g·L-1)、3′-甲氧基葛根素對照品貯備液(0.633 6 g·L-1)、牛蒡苷對照品貯備液(1.044 4 g·L-1)。分別精密量取4種對照品貯備液1、5、3、5 mL入25 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液溶液(綠原酸0.015 7 g·L-1，葛根素0.260 4 g·L-1，3′-甲氧基葛根素0.076 0 g·L-1，牛蒡苷0.208 9 g·L-1)。精密量取混合對照品儲備液10 mL置入20 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液(綠原酸0.007 8 g·L-1，葛根素0.130 2 g·L-1，3′-甲氧基葛根素0.038 0 g·L-1，牛蒡苷0.104 4 g·L-1)。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、5、10 μL，及混合對照品儲備液15 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，綠原酸進(jìn)樣量在0.003 9～0.235 3 μg范圍內(nèi)，Y=4.023 0×106X+10 618(r=0.999 9)；葛根素進(jìn)樣量在0.065 1～3.906 6 μg范圍內(nèi)，Y=5.830 3×106X+2.956 8×105(r=0.999 7)；3′-甲氧基葛根素進(jìn)樣量在0.019 0～1.140 4 μg范圍內(nèi)，Y=4.889 5×106X+17 397(r=0.999 8)；牛蒡苷進(jìn)樣量在0.052 2～3.133 1 μg范圍內(nèi)，Y=8.676 5×105X-13 927 (r=0.999 8)，表明線性良好。

2.4 定量限、檢測限 精密量取2 mL混合對照品溶液，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密吸取適量，用甲醇配制成一系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以信噪比(S/N)為3時(shí)測定檢測限，信噪比(S/N)為10時(shí)測定定量限。綠原酸檢出限為：0.084 5 ng，定量限為：0.281 5 ng，葛根素檢出限為：0.206 8 ng，定量限為：0.688 0 ng，3′-甲氧基葛根素檢測限為1.112 6 ng，定量限為3.708 6 ng；牛蒡苷檢測限為0.692 4 ng，定量限為2.308 0 ng。

2.5 精密度考察 對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，考察方法的精密度。綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素和牛蒡苷峰面積RSD分別為1.2%、0.92%、0.75%和0.91%。

2.6 重復(fù)性考察 按“2.1.1”項(xiàng)下平行制備5份樣品(批號：170202)溶液，分別測定綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素和牛蒡苷含量，結(jié)果樣品中平均含量分別為每袋1.23、21.51、5.19 和16.61 mg，RSD分別為1.5%、1.0%、1.4%和1.6%。

2.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液(批號：170202)分別于0、4、8、12、18和24 h進(jìn)樣分析，測定綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素和牛蒡苷的峰面積。結(jié)果，24 h內(nèi)峰面積RSD分別為1.0%、1.5%、1.8%和1.3%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的鳶都感冒顆粒樣品(批號：170202)6份，每份1 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，精密加入混合對照品液(濃度分別為：0.0078 g·L-1、0.1302 g·L-1、0.0380 g·L-1、0.1044 g·L-1)10 mL，再精密加入甲醇10 mL，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理，分別測定4種成分含量，計(jì)算回收率。結(jié)果，綠原酸平均回收率為99.3%，RSD為0.7%，葛根素平均回收率為98.6%，RSD為1.3%，3′-甲氧基葛根素平均回收率為99.4%，RSD為1.8%，牛蒡苷平均回收率為99.9%，RSD為0.9%，詳細(xì)結(jié)果見表1。

2.9 樣品測定 不同生產(chǎn)廠家鳶都感冒顆粒中綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素和牛蒡苷的含量測定結(jié)果見表2。

3 討論

葛根為豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉等功效，其化學(xué)成分主要為異黃酮類化合物葛根素、3-羥基葛根素、3-甲氧基葛根素等，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗感染、降血壓、降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、解酒等作用[2-3]。忍冬藤來源忍冬科植物忍冬的干燥莖枝，具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)功用。綠原酸是忍冬藤的主要有效成分之一，具有顯著的抗菌、抗病毒作用[4-5]。牛蒡子為菊科二年生草本植物牛蒡的干燥成熟果實(shí)，具有瀉熱解毒、潤肺透診、利咽喉痛之效，主要含牛蒡苷、牛蒡苷元等木脂素類成分及綠原酸等酚酸類成分[6]。童黃錦等[7]采用HPLC法對12 個(gè)產(chǎn)地炒牛蒡子中7個(gè)成分的含量進(jìn)行了測定，從7個(gè)成分的含量來看，各個(gè)產(chǎn)地牛蒡苷的含量最高。原鳶都感冒顆粒標(biāo)準(zhǔn)只有一項(xiàng)薄層色譜鑒別項(xiàng)目，無含量測定項(xiàng)目，本研究測定鳶都感冒顆粒中綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素和牛蒡苷含量，旨在更加有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

表1 回收率試驗(yàn)(n=6)

表2 樣品含量

本研究采用超聲提取法同時(shí)測定鳶都感冒顆粒中綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素和牛蒡苷含量，處理方法簡便易行，采用DAD檢測器進(jìn)行全波長掃描(200～400 nm)，分析4種組分的紫外光譜，選擇綠原酸最大吸收波長327 nm為吸收波長[8-9]，葛根素、3′-甲氧基葛根素的最大吸收波長250 nm[10-11]，牛蒡苷最大吸收波長278 nm，提高了檢測成分的靈敏度。在提取溶劑的選擇上，比較了提取溶劑(甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇)，對鳶都感冒顆粒中綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素和牛蒡苷含量的影響，4種溶劑對結(jié)果影響較小，而且考慮到對照品的溶劑為甲醇，確定了采用甲醇作為最終提取溶劑。在提取時(shí)間的選擇上，考察了提取時(shí)間(20、30和40 min)對提取率的影響，30 min各組分的響應(yīng)高于20 min，而繼續(xù)增加超聲時(shí)間對各組分響應(yīng)影響不大，確定了提取時(shí)間為30 min。在流動相的選擇上[12-13]，水-甲醇或水-乙腈條件下的色譜峰拖尾，分離度較差，以0.05%磷酸-乙腈為流動相時(shí)，色譜峰分離效果好，峰形尖銳，4種組分均具有較好的穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性，各組分分離效果良好，減少了測定誤差，結(jié)果重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)。