石 慧， 彭 銳， 鄒方東

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610065)

1 引 言

結(jié)直腸癌(Colorectal Carcinoma， CRC)包括結(jié)腸癌和直腸癌， 兩者主要存在解剖學(xué)上的區(qū)別[1].據(jù)2018年統(tǒng)計(jì)， 全球新增結(jié)直腸癌病例超過(guò)180萬(wàn)， 其中881 000例死亡[2-3].調(diào)查表明結(jié)直腸癌患者手術(shù)后5年內(nèi)生存率在40%～60%之間， 說(shuō)明手術(shù)后癌癥可能復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[4].另有很多患者在診斷時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)癌細(xì)胞向其他臟器轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[5].惡性程度較高的結(jié)直腸癌不僅會(huì)對(duì)化療藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性， 而且轉(zhuǎn)移幾率更高.因此研究結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制、尋找新的治療方式和治療靶點(diǎn)顯得尤為迫切.

SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物由多種亞基構(gòu)成， 根據(jù)核心催化亞基的不同可以分為BAF(BRG1/BRM associated factors, BAF)和PBAF(Polybromo-associated BAF, PBAF)兩大類(lèi)復(fù)合物.BAF類(lèi)復(fù)合物核心催化亞基包括具有ATP酶活性的BRM(Brahma, BRM)和BRG1(Brahma related gene1, BRG1)， 該復(fù)合物可以利用ATP水解的能量改變核小體的結(jié)構(gòu)和位置， 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子之間的結(jié)合， 從而激活或抑制轉(zhuǎn)錄[6-7].ARID1A(AT-rich interactive domain 1A， ARID1A)是SWI/SNF復(fù)合物的一個(gè)非催化亞基， 可以非特異性地與DNA結(jié)合， 招募其他組分到復(fù)合物中.

對(duì)結(jié)直腸癌樣本中ARID1A蛋白水平的臨床病理學(xué)分析結(jié)果顯示， 25.8%的原發(fā)性腫瘤不表達(dá)ARID1A， 51.2%有低水平的ARID1A表達(dá).并且在TNM(tumor-node-metastasis， TNM)一期到四期的腫瘤中ARID1A的缺失率達(dá)到7.4%～46.3%.這些數(shù)據(jù)說(shuō)明ARID1A在結(jié)直腸癌中的缺失與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系[8].本文通過(guò)干擾和過(guò)表達(dá)ARID1A， 研究其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響， 并通過(guò)GO和KEGG分析參與細(xì)胞遷移的ARID1A共表達(dá)基因所涉及的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路， 以期揭示ARID1A調(diào)控細(xì)胞遷移的分子機(jī)制.

2 材料與方法

2.1 材 料

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116， 人腎上皮細(xì)胞系HEK293T購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)；質(zhì)粒pLKO.1-TRC， pSPAX2， pMD2.G， pLenti-puro-ARID1A和pcDNA3.1(+)購(gòu)于Addgene公司；引物合成及測(cè)序由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成(引物序列見(jiàn)表1).

2.2 方 法

2.2.1 ARID1A基因干擾載體和過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 通過(guò)XhoⅠ和ScaⅠ雙酶切， 從pLenti-puro-ARID1A載體上得到ARID1A基因CDS區(qū)全長(zhǎng).同時(shí)用XhoⅠ酶切pcDNA3.1(+)質(zhì)粒， 將ARID1A片段與酶切后的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進(jìn)行連接， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌， 氨芐培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性菌落并測(cè)序， 得到ARID1A基因過(guò)表達(dá)載體；將shRNA-ARID1A-F和shRNA-ARID1A-R引物序列混合后置于98℃水浴變性3min， 自然冷卻至室溫(退火)， 與AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后回收的pLKO.1-TRC載體片段進(jìn)行連接， 測(cè)序鑒定得到ARID1A干擾載體， 同時(shí)用shRNA-scramble序列與pLKO.1-TRC載體片段連接作為對(duì)照， 與慢病毒載體pSPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞， 得到病毒濃縮液， 感染HCT116細(xì)胞.

2.2.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與Real-time PCR反應(yīng) 吸掉細(xì)胞培養(yǎng)皿/板中的培養(yǎng)基， PBS緩沖液洗1～2遍， 加入RNAiso Plus， 充分裂解細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的1.5 mL離心管中， 加入1/5樣品體積的氯仿， 快速振蕩混勻， 冰上靜置 2 min；靜止后可以看到液體分層， 然后4 ℃ 12 000 g離心15 min；吸取上層水相至另一干凈無(wú)RNA酶的新管中， 加入與液體相等體積的異丙醇；4 ℃ 12 000 g再次離心15 min， 除去上清， 加入預(yù)冷的75%的乙醇1 mL洗滌沉淀；4℃ 7 500 g 離心10 min， 吸掉上清， 室溫晾干5 min；加入20 μL DEPC水溶解， 按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成.

Real-time PCR反應(yīng)體系參照Innovagen 2×Taq SYBR Green master mix說(shuō)明書(shū).

2.2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將劃痕插件用酒精噴洗后， 自然晾干， 將有粘性的一面放入12孔板中.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化稀釋?zhuān)?計(jì)數(shù)， 按照插件每室50 000個(gè)細(xì)胞鋪板， 放入培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h左右， 待細(xì)胞貼壁后， 用鑷子輕輕拔去劃痕插件， 吸掉培養(yǎng)基， PBS洗兩遍， 換新的培養(yǎng)基， 在顯微鏡下拍照記錄；拔掉插件后0 h、24 h各記錄一次；用Image J軟件進(jìn)行遷移率分析.

2.2.4 ARID1A共表達(dá)基因的篩選、GO分析和KEGG分析 從Metabolic gEne RApid Visualizer1在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲取結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116與結(jié)直腸正常組織中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)， 篩選出與ARID1A相關(guān)系數(shù)大于0.9的共表達(dá)基因.通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)這些共表達(dá)基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway)通路分析.

3 結(jié) 果

3.1 獲得ARID1A基因過(guò)表達(dá)和穩(wěn)定干擾細(xì)胞株

為了觀察ARID1A基因過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞遷移的影響， 本研究首先從pLenti-puro-ARID1A載體上得到ARID1A基因CDS區(qū)全長(zhǎng)， 構(gòu)建了ARID1A-pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體.轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后， 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ARID1A基因的表達(dá)， 結(jié)果顯示ARID1A在HCT116細(xì)胞中表達(dá)量顯著增加(P<0.01)， 說(shuō)明成功過(guò)表達(dá)(圖1A).

將ARID1A基因干擾載體測(cè)序鑒定正確后(圖1B)， 進(jìn)行慢病毒包裝， 并感染HCT116細(xì)胞.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示ARID1A在HCT116細(xì)胞中表達(dá)量顯著降低(P<0.01)， 說(shuō)明干擾成功(圖1C).

3.2 ARID1A對(duì)HCT116細(xì)胞遷移的影響

為了探究ARID1A表達(dá)量升高或者下降是否會(huì)對(duì)HCT116細(xì)胞的遷移有影響， 用劃痕插件制造細(xì)胞劃痕， 觀察ARID1A過(guò)表達(dá)和ARID1A干擾后細(xì)胞遷移情況.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組細(xì)胞相比， ARID1A過(guò)表達(dá)會(huì)降低細(xì)胞遷移率(圖2A，P<0.05)， 而干擾ARID1A表達(dá)后， 細(xì)胞遷移率增加(圖2B，P<0.01).

圖1 ARID1A過(guò)表達(dá)載體與干擾載體的構(gòu)建

Fig. 1 Construction of ARID1A overexpression and interference vectors

A.ARID1A過(guò)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果， 對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體. B. ARID1A干擾載體測(cè)序結(jié)果；下劃線序列為干擾序列.C. ARID1A干擾檢測(cè)結(jié)果， 對(duì)照組用含shRNA-scramble序列的慢病毒感染.**P<0.01.

A.The expression level of ARID1A after overexpression was detected by qPCR. Control group was transfected with pcDNA3.1 (+) empty vector. B. The sequencing result of ARID1A interference vector. ShRNA-ARID1A sequence are underlined. C. The expression level of ARID1A after interference was detected by qPCR. Control group was infected with lentivirus containing shRNA-scramble.**P<0.01.

3.3 ARID1A共表達(dá)基因GO富集分析及KEGG通路分析

通過(guò)比較結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116與結(jié)直腸正常組織中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)， 從中篩選出1 212個(gè)相關(guān)系數(shù)大于0.9的ARID1A共表達(dá)基因.利用DAVID 在線工具將這些基因富集到生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路中.GO分析發(fā)現(xiàn)， 參與細(xì)胞增殖過(guò)程的基因僅有N4BP2L2, ACE, IF2AK2, PDCD2等4個(gè)基因， 參與細(xì)胞遷移過(guò)程的有PTEN, BRAF, IL23A, CCL21, NCKAP1L, LBP, JAM3, SLIT2, CD74, S100A8, PPBP, CCL13, NCKAP1L, WDR1, PTGER4, TMEFF2, SLURP1, COL3A1, DAG1, ARPIN, MIIP, PTPRU, DACH1, ADIPOQ, TRIB1, APOE, NKX2-1, HRG, CNN2等29個(gè)基因(圖3).KEGG分析發(fā)現(xiàn)， 與細(xì)胞遷移相關(guān)的基因富集于趨化因子信號(hào)通路、粘著斑、細(xì)胞因子受體相互作用等信號(hào)通路.

圖2 ARID1A過(guò)表達(dá)和干擾后細(xì)胞的遷移

Fig.2 Cell migration after ARID1A overexpression and interference

A.左圖：ARID1A過(guò)表達(dá)后細(xì)胞遷移的變化， 對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體. 右圖：細(xì)胞遷移的統(tǒng)計(jì)分析.B. 左圖：ARID1A干擾后細(xì)胞遷移的變化， 對(duì)照組用shRNA-scramble的慢病毒感染.右圖：細(xì)胞遷移的統(tǒng)計(jì)分析.*P<0.05，**P<0.01.

A.Left: The cell migration change after ARID1A overexpression in HCT116. The control group was transfected with pcDNA3.1(+) empty vector. Right: The statistical analysis of cell migration. B. Left: The cell migration change after ARID1A interference. The control group was infected with the lentivirus containing shRNA-scramble sequence. Right: The statistical analysis of cell migration.*P<0.05,**P<0.01.

圖3 GO分析參與細(xì)胞增殖和遷移的ARID1A共表達(dá)基因Fig.3 GO analysis of ARID1A co-expressed genes involved in cell proliferation and migration

4 討 論

染色質(zhì)重塑對(duì)細(xì)胞核活動(dòng)包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和DNA損傷修復(fù)等多方面有著至關(guān)重要的作用.與染色質(zhì)重塑相關(guān)研究已成為癌癥發(fā)病機(jī)制研究的新方向[9-10].隨著近年來(lái)基因測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展， 發(fā)現(xiàn)在多種人類(lèi)癌癥中存在ARID1A基因突變.在卵巢透明細(xì)胞癌中ARID1A的突變率約為57%[11]， 子宮內(nèi)膜癌中為23%～42%[12]， 結(jié)直腸癌中約為10%[13].本文發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中過(guò)表達(dá)ARID1A可以抑制細(xì)胞遷移， 而干擾其表達(dá)后， 細(xì)胞遷移率增加.在1212個(gè)與ARID1A相關(guān)系數(shù)大于0.9的共表達(dá)基因中， 參與細(xì)胞遷移的基因有29個(gè)， 這些基因參與趨化因子信號(hào)通路、粘著斑、細(xì)胞因子受體相互作用等信號(hào)通路.

其中， PTEN和BRAF是目前研究較多的與細(xì)胞遷移關(guān)系密切的基因.PTEN可以負(fù)調(diào)控AKT， 進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)程， 例如調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、粘附、遷移和侵襲等[14-15].BRAF在小鼠胚胎形成過(guò)程中對(duì)肢體骨骼肌的形成起著至關(guān)重要的作用， 是誘導(dǎo)成肌細(xì)胞遷移的重要因子[16].本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中PTEN與ARID1A的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)， BRAF與ARID1A的表達(dá)呈正相關(guān)， 但是ARID1A, PTEN和BRAF在細(xì)胞遷移中的調(diào)控關(guān)系還有待深入研究.

有文獻(xiàn)報(bào)道， 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ARID1A， 發(fā)現(xiàn)磷酸化的AKT表達(dá)量降低[17].在胃癌細(xì)胞中缺失內(nèi)源性的ARID1A， 可以加快細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)以及營(yíng)養(yǎng)攝入， 并伴隨著PI3K/AKT信號(hào)的激活， 上調(diào)磷酸化的PDK1、AKT、GSK3β、70S6K以及PI3K、PDK1水平.PIK3CA和PDK1是ARID1A參與形成的SWI/SNF復(fù)合物的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)， 使用分別靶向AKT和PI3K的變構(gòu)抑制劑MK2206和LY294002， 可以通過(guò)下調(diào)激活的PI3K/AKT信號(hào)， 有效抑制ARID1A缺失的胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和葡萄糖攝入[18].這些數(shù)據(jù)說(shuō)明， ARID1A與PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中存在密切的調(diào)控關(guān)系， 推測(cè)ARID1A可能也通過(guò)該信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞遷移， 但是具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí).

綜上所述， 本文發(fā)現(xiàn)ARID1A可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移， 并通過(guò)GO分析和KEGG分析， 得到參與細(xì)胞遷移過(guò)程的與ARID1A相關(guān)系數(shù)大于0.9的共表達(dá)基因及其涉及的信號(hào)通路， 為進(jìn)一步探索ARID1A調(diào)控細(xì)胞遷移的機(jī)制提供了研究方向和理論基礎(chǔ).