,3,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室,江蘇南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014;3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

肉制品在加工過程中容易發(fā)生脂質氧化,影響肉制品的風味。脂類物質的氧化分為自動氧化和酶促氧化[1],脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)是酶促氧化最主要的內源酶[2]。LOX專一性作用于多不飽和脂肪酸(PUFA)的順,順-1,4-戊二烯基位置,通過分子內加氧,生成具有共軛雙鍵的氫過氧化物[3]。生成的氫過氧化物極不穩(wěn)定,可以進一步反應生成多種揮發(fā)性化合物,這些物質一方面形成食品的主要風味物質,例如新鮮水果蔬菜的風味物質醛類即由LOX氧化多不飽和脂肪酸途徑生成,干腌肉制品的主要風味物質己醛也是脂質氧化降解生成[4-5];另一方面,食品中脂質的過度氧化會產(chǎn)生不愉悅氣味物質[6],不僅導致食品風味劣變,還造成食物多不飽和脂肪酸含量下降,導致食物營養(yǎng)品質的下降和增加食品儲藏的困難[7-10]。

姜黃素(Curcumin)是從一些姜黃科植物姜黃、莪術、郁金等植物的根莖中提取的[11-12],是一種脂溶性熒光分子,存在β-二酮結構的多酚化合物[13](結構式見圖1)。研究發(fā)現(xiàn),姜黃素有一些獨特的藥理作用,是一種天然的常用中藥,具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[14-16]。同時姜黃素也是一種穩(wěn)定的天然色素和天然防腐劑,有一定的營養(yǎng)價值[17]。作為食品添加劑,我國在1981年允許姜黃素用于食品行業(yè),如果蔬飲料、糕點、罐頭等。研究姜黃素與豬12-LOX的相互作用不僅對了解姜黃素在畜產(chǎn)品加工領域有重要理論價值,還能為姜黃素作為一種天然的食品添加劑在食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供可靠的理論基礎和科學依據(jù)。

本研究通過紫外分光光度法、熒光光譜法、圓二色譜法,研究姜黃素與豬12-LOX之間的相互作用,包括姜黃素抑制住12-LOX的IC50,結合常數(shù)、結合位點數(shù)、結合作用力以及姜黃素對豬12-LOX結構變化的影響,探討姜黃素與豬12-LOX的結合規(guī)律與作用機理,為姜黃素調控肉品品質提供理論依據(jù)。

圖1 姜黃素結構式Fig.1 Structure of curcumin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬12-LOX 前期實驗室制備(以亞油酸為底物的比酶活為2826.7 U/mg,蛋白濃度為9.57 mg/mL);亞油酸、姜黃素、二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;吐溫-20 南京中東化玻儀器有限公司;檸檬酸、檸檬酸三鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等 均為國產(chǎn)分析純。

BioTekSynergy2多功能酶標儀 美國BioTek公司;M124A分析天平 意大利BEL公司;HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;JASCO J-1500圓二色譜儀 日本島津有限公司;LS-55 Fluorescence Spectrometer 美國PerkinElmer公司;OHAUSST20筆試pH計 上海翼彩檢測儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑配制 亞油酸底物溶液配制:將0.5 mmol亞油酸溶于5 mL(含180 μL Tween 20)的脫氧重蒸水中,使其充分混勻;逐滴滴加1 mol/L NaOH充分混勻直至體系成為清澈透明的液體,再用1 mol/L HCl調pH至9.0,直至亞油酸完全溶解,最后用脫氧重蒸水定容至50 mL。準備數(shù)支4 mL EP管,并將該亞油酸儲備液分裝保存在EP管中,并于-20 ℃下保存?zhèn)溆肹18]。

姜黃素溶液配制:用DMSO和吐溫20以1∶1的體積比配置成100 μg/mL的姜黃素溶液,實驗時稀釋至所需濃度。

1.2.2 姜黃素對豬12-LOX活力的影響

1.2.2.1 豬12-LOX酶活測定 豬12-LOX的酶活測定方法在Kermasha等[19]的基礎上進行改進。將20 μL亞油酸底物儲備液與160 μL、50 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH5.5)充分混勻,加入20 μL豬12-LOX酶液,迅速混勻,在234 nm處測定其1.0 min內吸光度值的增加量。以不加酶液即20 μL亞油酸底物與180 μL檸檬酸緩沖液混合液為空白。LOX酶活為在一定的溫度和pH條件下,反應體系在234 nm波長處吸光度每分鐘增加0.001表示為1個酶活力單位(U)[20]。相對酶活:以酶活最高值為100%,計算不同條件下的相對酶活。

1.2.2.2 豬12-LOX酶活抑制率的測定 向酶活反應體系中加入姜黃素使其終濃度分別為0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、30、40、50 μg/mL;以不加姜黃素的反應體系作為對照組;以不加酶液和姜黃素的作為空白對照;體系混勻后在234 nm處測定1 min內吸光值的變化,按以下公式計算抑制率(IR),并計算其IC50值。

式(1)

式中:A1為實驗組吸光度的變化量;A2為對照組吸光度的變化量;A3為空白組吸光度的變化量。

1.2.3 姜黃素對豬12-LOX熒光光譜的影響

1.2.3.1 熒光光譜測定 向一定濃度的豬12-LOX蛋白溶液中加入不同量的姜黃素溶液,使最終蛋白濃度為20 mg/L,姜黃素的濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL,準備3組樣品,分別于288、298、308 K的恒溫水浴鍋中水浴5 min后測定。常規(guī)內源性熒光光譜測定條件:激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射光譜掃描范圍為250～450 nm,激發(fā)及發(fā)射狹縫寬為5 nm,速率1200 nm/min;

1.2.3.2 同步熒光光譜 向一定濃度的豬12-LOX蛋白溶液中加入不同量的姜黃素溶液,使最終蛋白濃度為20 mg/L,姜黃素的濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL,室溫條件下測定。同步熒光光譜測定條件如下:25 ℃,分別固定Δ λ=15 nm 和Δλ=60 nm,進行同步熒光光譜掃描,掃描范圍250～350 nm,激發(fā)及發(fā)射狹縫寬為5 nm,速率1200 nm/min。

1.2.3.3 熒光猝滅機制的判定 小分子結合蛋白的熒光猝滅機制分為靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅,靜態(tài)猝滅由于猝滅劑與熒光基團形成復合物,其猝滅常數(shù)隨著溫度的上升呈下降的趨勢。動態(tài)猝滅表現(xiàn)為溫度的升高增加離子的擴散和碰撞,其猝滅常數(shù)隨著溫度的上升而增大。利用 Stern-Volmer 方程對猝滅類型進行判斷[21]:

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]

式(2)

式中:F0和F分別是不添加姜黃素與添加不同濃度姜黃素的熒光強度;[Q]是姜黃素的濃度(mol/L),Ksv是動態(tài)猝滅常數(shù)(L/mol);Kq是生物大分子猝滅速率常數(shù)(L/(mol·s)),τ0是不存在猝滅劑時熒光分子的壽命,平均壽命約為10-8s。

1.2.3.4 結合常數(shù)和結合位點數(shù)的計算 靜態(tài)猝滅中,熒光猝滅強度和猝滅劑濃度之間遵循公式(3)[22],通過公式(3)計算熒光分子和猝滅劑的結合常數(shù)和結合位點數(shù)確定其相互作用的強度。

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

式(3)

其中:F0和F分別是不添加姜黃素與添加不同濃度姜黃素的熒光強度;[Q]是姜黃素的濃度(mol/L);KA是結合常數(shù);n為結合位點。

1.2.3.5 熱力學參數(shù)與相互作用類型 根據(jù)Van’t Hoff范特霍夫方程及其推導的公式計算熱力學參數(shù)[23-24]。

ln(K2/K1)=-(1/T2-1/T1)ΔH/R,ΔG=-RTlnK,ΔG=ΔH-TΔS

式(4)

式中:ΔH、ΔG和ΔS分別表示焓變,自由能變化和熵變;R為氣體常數(shù) 8.314 J ·mol-1·K-1,T是實驗溫度;K為相應溫度下的結合常數(shù)。

1.2.4 圓二色譜(CD)分析 CD光譜能夠有效分析蛋白質二級結構的變化,常用于蛋白質二級結構的測定[25]。以磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.6)作為空白對照,實驗組為不加姜黃素的LOX酶液和加入姜黃素的LOX酶液。CD光譜的掃描波長范圍為200～250 nm,光源為氙燈,液池光徑為1 mmol/L,在范圍內掃描累加3次。掃描速度為50 nm/min,LOX 酶液濃度為 0. 1 mg·mL-1。用平均橢圓率[θ]來表示CD數(shù)據(jù),單位為deg·cm2·dmol-1[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗做3個平行,采用Excel進行數(shù)據(jù)分析與處理,Origin 8.0和SPSS進行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2 結果與分析

2.1 姜黃素對豬12-LOX活力的影響

不同濃度的姜黃素對豬12-LOX酶相對活力和抑制率的影響如圖2所示。結果表明,隨著姜黃素濃度的增加,豬12-LOX酶相對活力逐漸下降,在姜黃素濃度為4 μg/mL時,豬12-LOX活力下降45.9%,姜黃素濃度為50 μg/mL時,豬12-LOX活力下降至初始酶活的10.3%。根據(jù)公式(1)分別計算不同姜黃素濃度下的抑制率,結果如圖2所示,當姜黃素濃度為4 μg/mL時,抑制率為54.06%,用SPSS軟件分析求得IC50=2.156 μg/mL,姜黃素濃度為50 μg/mL時,抑制率達到90.12%,表明姜黃素對豬12-LOX的抑制作用明顯。

圖2 不同姜黃素濃度對豬12-LOX酶活力和抑制率的影響Fig.2 Effects of different curcumin concentrations on the activity and inhibition rate of porcine 12-LOX

2.2 姜黃素對豬12-LOX熒光光譜的影響

2.2.1 熒光強度的影響 如圖3所示,姜黃素的加入,使得豬12-LOX的熒光強度減弱,姜黃素濃度越高,熒光強度越低,說明姜黃素對LOX蛋白的熒光有猝滅作用,且猝滅效果隨著姜黃素濃度的增加而增大。豬12-LOX的λmax發(fā)生了一定的紅移,這說明姜黃素能夠與豬12-LOX相互作用,使豬12-LOX中色氨酸所處的周圍環(huán)境極性增加,使其向親水性環(huán)境發(fā)生轉變,從而使蛋白質的分子結構變得松散[27-28]。

圖3 姜黃素對豬12-LOX熒光光譜的影響Fig.3 Effects of curcumin on fluorescence spectrum of porcine 12-LOX注:1～7分別對應姜黃素濃度為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL;圖6同。

2.2.2 熒光猝滅機理研究

2.2.2.1 熒光猝滅機制的判定 根據(jù)Stern-Volmer 方程(2),以F0/F為縱坐標,姜黃素濃度[Q]為橫坐標進行線性擬合,經(jīng)Origin 8.0繪圖得到(圖4),進一步得出姜黃素與豬12-LOX相互作用的動態(tài)猝滅常數(shù)(Ksv)和生物大分子猝滅速率常數(shù)(Kq)(表1)。對于生物大分子,各類猝滅劑由擴散碰撞產(chǎn)生的最大動態(tài)猝滅常數(shù)為 2×1010L/(mol·s)[29-30]。由表1可知,在288、298、308K溫度下,姜黃素與豬12-LOX相互作用的Kq值遠大于 2×1010L/(mol·s),表明姜黃素對豬12-LOX的猝滅機理是姜黃素與蛋白結合形成基態(tài)穩(wěn)定復合物所引起的靜態(tài)猝滅。

表1 豬12-LOX與姜黃素復合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關系數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants(KSV)and molecular quenching constants(Kq)for porcine 12-LOX and curcumin systems

表2 姜黃素與豬12-LOX復合物的結合位點數(shù)、表觀結合常數(shù)及線性相關系數(shù)Table 2 Apparent binding constants,binding sites and linear correlation coefficients of curcumin and porcine 12-LOX systems

表3 姜黃素與豬12-LOX結合的相關熱力學參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of curcumin and porcine 12-LOX systems

圖4 不同溫度條件下姜黃素猝滅豬12-LOX的Stern-Volmer圖Fig.4 Stern-Volmer plot of F0/F as a function of curcumin concentration at different temperatures for curcumin and porcine 12-LOX systems

2.2.2.2 結合常數(shù)和結合位點的計算 根據(jù)公式(3),以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖(圖5),計算出不同溫度條件下姜黃素與豬12-LOX相互作用的表觀結合常數(shù)(KA)和結合位點數(shù)(n)(表2)。如表2所示,隨著溫度的升高,結合常數(shù)KA值降低,說明姜黃素與豬12-LOX的反應是一個放熱過程;結合常數(shù)較大,說明兩者有較強結合作用;二者的結合位點數(shù)在各個溫度下也都約為1,說明姜黃素與豬12-LOX蛋白之間形成了摩爾比約1∶1的靜態(tài)復合物[31]。

圖5 不同溫度條件下姜黃素猝滅豬12-LOX的雙對數(shù)圖Fig.5 Plot of lg[(F0-F)/F]as a function of log of curcumin concentration at different temperatures for curcumin and porcine 12-LOX systems

2.2.2.3 小分子和蛋白結合的相互作用力主要有四種:ΔH>0、ΔS>0 時,疏水相互作用;ΔH>0、ΔS<0 時,靜電和疏水相互作用;ΔH<0、ΔS<0 時,范德華力和氫鍵相互作用;ΔH<0、ΔS>0 時,靜電相互作用[23]。由表3得出ΔH<0、ΔS<0,表明姜黃素與豬12-LOX的主要作用力為范德華力和氫鍵,ΔH<0表明姜黃素與豬12-LOX之間的反應是放熱的,與2.2.2.2結論一致。ΔG<0,表明兩者之間的反應是自發(fā)的。

2.2.3 同步熒光光譜 同步熒光分析被應用于研究蛋白質的構象,特別是熒光基團微環(huán)境的變化,具有選擇性高、譜圖簡化、光散射干擾少等特點[32]。通過設定激發(fā)波長與發(fā)射波長之間的固定波長差(Δλ),來獲得熒光光譜。當 Δ λ=15 nm 時,只顯示酪氨酸殘基的特征熒光光譜;當 Δ λ=60 nm 時,只顯示色氨酸殘基的特征熒光光譜[33]。通過氨基酸殘基最大吸收波長的變化,判斷氨基酸所處微環(huán)境的變化,若最大發(fā)射波長紅移,表明微環(huán)境的親水性增加,藍移則表明疏水性增加。

圖6 姜黃素與豬12-LOX體系的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of curcumin and porcine 12-LOX systems注:A:Δλ=15 nm;B:Δλ=60 nm。

由圖6可知,隨著姜黃素濃度的增加,豬12-LOX的兩個不同波長差的同步熒光光譜均明顯降低,表明豬12-LOX分子中的酪氨酸和色氨酸殘基均由于姜黃素的加入而被不同程度的猝滅,但相比之下,色氨酸被猝滅的程度大于酪氨酸,由此可判斷姜黃素主要結合在豬12-LOX的色氨酸殘基上;另外,Δλ=60 nm的譜圖表現(xiàn)出明顯的紅移現(xiàn)象,而Δλ=15 nm譜圖的出峰位置幾乎沒有變化,這說明姜黃素與豬12-LOX的結合位點更接近于色氨酸殘基[34]。因此,當豬12-LOX與姜黃素結合后,主要作用于豬12-LOX的色氨酸附近,使色氨酸周圍微環(huán)境的親水性增強,極性增加[34-36],進而使豬12-LOX的分子結構變得松散,與2.2.1得出的結果相對應。

2.3 圓二色譜

蛋白質二級結構中主要的光活性基團是肽鍵,其吸收峰分布在蛋白質圓二色譜(Circular dichrosim spectra,CD)的遠紫外區(qū)段(190～240 nm),一般來說α-螺旋特征吸收峰在208和222 nm左右,β-折疊在215 nm左右有一特征吸收負峰[37-38]。如圖7所示,天然狀態(tài)的LOX的遠紫外圓二色譜在208和222 nm處顯示負雙峰曲線,在215 nm處顯示一個負肩峰。在加入姜黃素后,12-LOX在208、222和215 nm處的特征吸收峰強度下降,表明姜黃素的加入使豬12-LOX內的二級結構α-螺旋和β-折疊的含量降低。

圖7 姜黃素猝滅豬12-LOX相互作用的圓二色譜圖Fig.7 CD spectra of the curcumin and porcine 12-LOX systems

3 結論

本文采用分光光度計,熒光光譜,同步熒光光譜,圓二色譜等方法研究了姜黃素與豬12-LOX的相互作用及對蛋白質結構的影響,結果表明姜黃素對豬12-LOX酶活力起抑制作用,且隨姜黃素濃度的增加,抑制作用增強,對實驗結果進行線性擬合,計算出了IC50值為2.156 μg/mL。

熒光圖譜結果表明姜黃素對豬12-LOX有熒光猝滅作用,猝滅機制屬于靜態(tài)猝滅,兩者之間主要通過范德華力和氫鍵結合。

姜黃素與豬12-LOX的結合位點數(shù)n接近1,形成了摩爾比約1∶1的靜態(tài)復合物。同步熒光光譜表明姜黃素與豬12-LOX的結合位點更接近色氨酸殘基。

圓二色譜表明,姜黃素的加入降低了豬12-LOX蛋白質二級結構中α-螺旋和β-折疊的含量。