張欣悅，羅翠琴，陳小潔，王其，王璐，丁婷

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，安徽合肥長江西路130號 230036

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）所引起的一種細(xì)菌性土傳病。目前，煙草青枯病的防治以化學(xué)藥劑為主，但化學(xué)藥劑的大量持續(xù)性施用易造成病原菌抗藥、環(huán)境污染等難以克服的問題，不利于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。隨著農(nóng)作物病害防治技術(shù)的進(jìn)步，煙草青枯病的生物防治日益引起科研工作者的重視。

健康植株根際是微生物定殖和發(fā)揮活性的重要區(qū)域，其根際土壤中含有的大量有益微生物對植物病害的生物防治具有重要意義。如在植物根際廣泛存在的假單孢桿菌可產(chǎn)生嗜鐵素，通過在根際掠奪其他有害或病原菌生長所必需的Fe 元素，而使病原菌活性降低，生長緩慢[1]；利用能夠促進(jìn)植物生長的根際細(xì)菌（PGPR）可以抑制植物土傳病害[2]。為了篩選對煙草青枯病有拮抗作用的微生物并研究其機(jī)理，本試驗(yàn)對表現(xiàn)優(yōu)異的菌株開展芽孢桿菌生防標(biāo)記基因的檢測，并研究煙草根系分泌物及其所含的各種有機(jī)酸對拮抗菌根部定殖的影響，旨在明確拮抗菌的生防機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)利用優(yōu)良的生防菌株提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

煙草青枯病菌由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理教研室提供，屬1 號生理小種。

拮抗菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 自貴州地區(qū)健康煙株根際土壤中分離純化得到，均為貝萊斯芽孢桿菌，其NCBI 登錄號分別為MH341165.1 和MH341164.1。

解淀粉芽孢桿菌模式菌株FZB42 由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試煙草品種和培養(yǎng)基

供試煙草品種分別為煙草K326 及紅花大金元，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理教研室江彤教授課題組提供。

生防菌的培養(yǎng)、分離以及抑菌活性的測定均使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）[3]；脂肽物質(zhì)培養(yǎng)使用Landy 培養(yǎng)基[4]。

煙草青枯病菌的培養(yǎng)使用TTC 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2，加入1 %TTC 混合均勻。

1.2 兩株煙草拮抗細(xì)菌對煙草青枯病菌的活性測定

將煙草拮抗細(xì)菌GZYCT-4 和GZYCT-9 分別接種到50 mL NA 液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速180 r/min、28℃條件下發(fā)酵24 h，得到GZYCT-4 和GZYCT-9 的液體發(fā)酵物。

拮抗細(xì)菌對煙草青枯病菌的活性測定采用牛津杯法[5]：取1 mL 煙草青枯病菌菌懸液（1×106cfu/mL），與20 mL 融化的冷卻至45℃的TCC 培養(yǎng)基充分混合均勻，制成含煙草青枯病菌的培養(yǎng)基；平板邊緣各距中心2.5 cm 處放置牛津杯（孔直徑為6 mm），吸取0.2 mL GZYCT-4 和GZYCT-9 液體發(fā)酵物于牛津杯孔內(nèi)，以無菌NA 液體培養(yǎng)基為對照。置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈大小。每個處理重復(fù)3 次。

1.3 拮抗菌株對煙草青枯病的盆栽防效試驗(yàn)

2018 年7 月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地農(nóng)萃園進(jìn)行。選擇煙草青枯病感病品種紅花大金元和抗病品種K326 進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)用土為混配營養(yǎng)土（細(xì)黃土:泥炭土＝1:1(V/V)）。采用拌土接種法，煙草青枯病菌的接種量為5×106 cfu /g 土。在煙草移栽前，每盆撒入200 g 菌土（每缽裝土4 kg）。

試驗(yàn)設(shè)置5 種處理：①病原菌處理組：4 葉期煙苗移栽至含有青枯病菌菌土的盆缽，緩苗2 d 后，進(jìn)行正常水肥管理；②拮抗菌GZYCT-4（1×108cfu /mL）處理組：4 葉期煙苗根部侵入GZYCT-4 菌懸液中，蘸根30 min 后，移栽至含有青枯病菌菌土的盆缽，緩苗2 d 后，采取灌根接種的方法，每株分別灌15 mL的GZYCT-4 菌懸液，重復(fù)接種2 次，間隔期為15 d；③拮抗菌GZYCT-9（1×108 cfu /mL）處理組：4 葉期煙苗的蘸根和灌根處理方式和處理時間同GZYCT-4處理組；④72%農(nóng)用硫酸鏈霉素處理組：4 葉期煙苗移栽至含有青枯病菌菌土的盆缽，緩苗2 d 后，每株灌40 mL 濃度1.25 mg/mL 的 72 % 農(nóng)用硫酸鏈霉素可濕性粉劑溶液；⑤空白對照處理組：4 葉期煙苗移栽至不含青枯菌的混配營養(yǎng)土中，緩苗2 d 后，每株灌15 mL 的滅菌NA 液體培養(yǎng)基。每個處理20 盆，3 次重復(fù)。植株置于28～36℃防蟲溫室內(nèi)培養(yǎng)，在煙草旺長期調(diào)查不同處理組煙草青枯病的發(fā)病情況[6]，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.4 拮抗菌株抗菌脂肽物質(zhì)的檢測

1.4.1 拮抗菌株脂肽粗提物的制備

將GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株接種于NA 培養(yǎng)液中，在30℃、200 r/min 條件下發(fā)酵24 h，得到拮抗菌的液體發(fā)酵物。分別吸取5 mL 拮抗菌液體發(fā)酵物接種于150 mL Landy 液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)38 h 后，培養(yǎng)液離心去除菌體細(xì)胞，上清液加入 HCl（6 mol/L）調(diào)pH 至 2.0，4℃靜置過夜，收集沉淀，向沉淀中加入適量色譜級甲醇，用無菌棒攪拌溶解，4℃靜置8 h，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，凍干，即為脂肽粗提物。脂肽粗提物無菌水溶解，配制成100 μg/mL 的母液，備用[7-8]。

1.4.2 拮抗菌株脂肽類粗提取物的平板拮抗試驗(yàn)

采用牛津杯法，含煙草青枯病菌的培養(yǎng)基制備方法同1.2，距培養(yǎng)皿邊緣2 cm 處對稱放置牛津杯，牛津杯中分別加入150 μL GZYCT-4 和GZYCT-9 脂肽類物質(zhì)粗提物，以解淀粉芽孢桿菌菌株FZB42 的脂肽粗提物（100 μg/mL）為陽性對照，無菌水作為陰性對照，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈大小。每個處理重復(fù)3 次。

1.4.3 拮抗菌生防標(biāo)記基因的鑒定

用于生防標(biāo)記基因 bmy B、fen D、itu C、srf AA、srf AB、bio A、yng G 和ynd J 的8 對特異引物均在安徽通用生物公司合成，引物序列見表1，擴(kuò)增條件參考楊瑞先[9]等方法。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后測序，測序所得序列通過NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對。

1.5 煙草根系分泌物及有機(jī)酸對拮抗菌根部定殖的影響

1.5.1 不同煙草品種根系分泌物的制備

煙草根系分泌物收集參考吳凱[10]等方法，將煙草種子播種在裝有泥炭土的盆缽中，放置在溫室中培養(yǎng)（28～30 ℃，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗交替）。30 d 后，待煙草長至15～20 cm 左右時，取出整株煙草，在自來水下沖洗干凈根系，蒸餾水潤洗三次，隨后將其轉(zhuǎn)入盛有150 mL 無菌雙蒸水的燒杯中，所有根系都浸入水中（28～30 ℃，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗交替）。培養(yǎng)48 h 后，收集培養(yǎng)液，冷凍干燥，得到煙草根系分泌物凍干粉。稱取適量根系分泌物凍干粉，用無菌水配成濃度10 mg/mL 的母液，置于4℃冰箱備用。

表 1 用于鑒定脂肽合成基因的引物Tab. 1 Primer sequences used for identification of ipopeptide synthesis genes

1.5.2 煙草根系分泌物中有機(jī)酸的測定

利用高效液相色譜（HPLC, Agilent1200,USA）鑒定煙草根系分泌物中有機(jī)酸的種類及含量。流動相以及檢測條件參照Tan[11]等方法，有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品包括草酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和富馬酸等共9種有機(jī)酸（Sigma 生物公司，分析純）。在相同色譜條件下，對混合標(biāo)樣和待測根系分泌物進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積保留時間，通過與標(biāo)樣保留時間的比對鑒定樣品中有機(jī)酸的種類。

1.5.3 煙草根系分泌物及有機(jī)酸對拮抗菌定殖影響

GZYCT-4 和GZYCT-9 液體發(fā)酵產(chǎn)物高速離心，收集菌體，磷酸緩沖液沖洗菌體，并調(diào)整至OD600=0.1。參照Rudrappa 等[12]方法，1 mL 注射器針頭分別吸取100 μL 的紅花大金元（10 mg/mL）和K326（10 mg/mL）煙草根系分泌物溶液、蘋果酸（10 μg/mL）、草酸（10 μg/mL）、檸檬酸（10 μg/mL）、琥珀酸（100 μg/mL）樣品溶液，且吸取100 μL 無菌水作為陰性處理組；200 μL 槍頭吸取100 μL拮抗菌菌液，將含有不同樣品的注射器的針頭插入裝有菌液的槍頭細(xì)口端，使根系分泌物、有機(jī)酸溶液或無菌水和菌液充分接觸，30℃無菌條件下水平放置3 h后，將注射器中的煙草根系分泌物、有機(jī)酸溶液和無菌水采用系列稀釋法，涂布平板計(jì)數(shù)其中拮抗菌的菌數(shù)。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 軟件中的Duncan 新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株煙草拮抗細(xì)菌對煙草青枯病菌的活性檢測

牛津杯平板培養(yǎng)法測定GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株對青枯病菌的抑菌活性如表2 所示，GZYCT-4 和GZYCT-9 對煙草青枯病菌的抑菌圈直徑分別為16.64 mm 和18.90 mm，GZYCT-9 對煙草青枯菌的抑菌活性顯著優(yōu)于GZYCT-4。

表2 煙草根際細(xì)菌GZYCT-4 和GZYCT-9 對青枯病菌的拮抗作用Tab.2 Antifungal activities of GZYCT-4 and GZYCT-9 against Ralstonia solanacearum

2.2 拮抗菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 的盆栽控病試驗(yàn)

旺長期調(diào)查五個處理組的煙草植株青枯病的發(fā)病情況，結(jié)果如表3 所示。經(jīng)GZYCT-4 菌懸液處理的紅花大金元煙株對青枯病的防效達(dá)到了51.83%，與農(nóng)用鏈霉素處理組防效（52.51%）無明顯差異，與GZYCT-9 處理組防效（38.96%）有顯著差異；而經(jīng)GZYCT-9 菌懸液處理的抗病品種K326 煙株，其病情指數(shù)明顯低于病原菌處理組，其青枯病的防治效果達(dá)到58.62%，與農(nóng)用鏈霉素處理組防效（61.01%）有一定差異，與GZYCT-4處理組防效（32.14%）有顯著差異。由上述結(jié)果可知，GZYCT-4 和GZYCT-9 拮抗菌施用到不同的抗感病煙草品種上，均能有效地防控其煙草青枯病的發(fā)病程度，其中，GZYCT-9 對K326 煙株防治效果優(yōu)于GZYCT-4 拮抗菌處理，而GZYCT-4 對紅花大金元煙株防治效果則優(yōu)于GZYCT-9 拮抗菌。

表3 不同處理組的青枯病害防治效果Tab. 3 Disease reduction of tobacco bacteria wilt in different treatment groups

2.3 拮抗菌株抗菌脂肽物質(zhì)分析

2.3.1 拮抗菌脂肽粗提物對煙草青枯病菌的抑制作用

利用牛津杯法，以解淀粉芽胞桿菌FZB42 作為陽性對照，檢測拮抗菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 的脂肽粗提物對煙草青枯病菌的抑制作用，結(jié)果如圖1 和表4 所示，GZYCT-4 和GZYCT-9 脂肽粗提物在100 μg/mL 濃度下，抑菌圈直徑分別達(dá)到16.24 mm和20.71 mm，相同濃度的FZB42 脂肽粗提物對煙草青枯病菌的抑菌圈直徑則為19.53 mm，供試拮抗菌脂肽提取物對煙草青枯菌的拮抗作用大小依次為GZYCT-9＞FZB42＞GZYCT-4，以GZYCT-9 的脂肽提取物對煙草青枯病菌的抑菌活性最強(qiáng)。

2.3.2 拮抗菌株生防標(biāo)記基因的擴(kuò)增結(jié)果

利用 8 對生防標(biāo)記基因的特異引物[13]，通過PCR 檢測拮抗菌株的部分生防標(biāo)記基因，發(fā)現(xiàn)GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株中均含有參與脂肽類家族細(xì)菌素（bmyB）、芬芥素（fenD）、伊枯草菌素（ituC）、表面活性素（srfAA、srf AB）以及生物素操縱子（bioA）和假定蛋白（yngG 、 yndJ）合成的基因（圖2）。結(jié)果表明菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 可能具有產(chǎn)生上述生防物質(zhì)的能力。將擴(kuò)增獲得的特異條帶回收純化，克隆測序獲得序列，利用BLASTX 將獲得的序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中相關(guān)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個菌株與解淀粉芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的生防功能基因的蛋白質(zhì)序列同源性在93%以上。兩個菌株的部分生防功能基因如fenD和ituC的蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果如圖3 所示，GZYCT-4和GZYCT-9 的fenD 蛋白質(zhì)序列均與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（KR149329.1）fenD 蛋 白質(zhì)序列親緣關(guān)系最近，而兩個菌株的ituC 蛋白質(zhì)序列與解淀粉芽孢桿菌ituC 蛋白質(zhì)序列親緣關(guān)系較近，由此可知，試驗(yàn)利用特異引物所擴(kuò)增到的基因片段為相應(yīng)的生防功能基因序列。

表4 拮抗菌株脂肽粗提物對煙草青枯病菌的拮抗作用Tab. 4 Antifungal activities of GZYCT-4 and GZYCT-9 lipopeptides against R. solanacearum

圖 1 拮抗菌脂肽粗提物對煙草青枯菌的拮抗效果Fig. 1 Antifungal activities of GZYCT-4 and GZYCT-9 lipopeptides against R. solanacearum

圖 2 GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株生防標(biāo)記基因擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Detection of Bacillussubtilis bio-control genes for GZYCT-4 and GZYCT-9 strains

圖 3 GZYCT-4 和GZYCT-9fenD 和ituC 的蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Protein sequence phylogenetic tree of GZYCT-4 and GZYCT-9 fenD and ituC

2.4 煙草根系分泌物及有機(jī)酸對拮抗菌根部定殖的影響

2.4.1 不同品種煙草根系分泌物中有機(jī)酸的組成

不同品種煙草根系分泌物的HPLC 檢測結(jié)果以及根系分泌物含有的各種有機(jī)酸的含量分別如圖3 和表5 所示，紅花大金元以及K326 兩個煙草品種的根系均能分泌草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機(jī)酸，但是各有機(jī)酸的分泌量各不相同，其中，K326 和紅花大金元兩種煙草的根系分泌物中，琥珀酸的含量均最高，草酸的含量則稍低，且K326 分泌琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸以及草酸的能力強(qiáng)于紅花大金元，其根系分泌物中上述四種酸的含量均明顯高于紅花大金元。此外，富馬酸在紅花大金元根系分泌物中含量為17.37 mg/kg，在K326 根系分泌物中沒有檢出，因此，在后期試驗(yàn)中，將選擇草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等四種有機(jī)酸進(jìn)行拮抗菌的趨化研究。

表5 紅花大金元和k326 根系分泌物中有機(jī)酸含量Tab. 5 Organic acid contents in root exudates of Dajinyuan and K326

2.4.2 煙草根系分泌物及其產(chǎn)生的有機(jī)酸對拮抗菌趨化性的影響

利用趨化性試驗(yàn)，探究煙草根系分泌物及其所含的各種有機(jī)酸對拮抗菌根部定殖的影響，結(jié)果如圖4 所示，拮抗菌GZYCT-4 和GZYCT-9 均可利用紅花大金元和K326 品種的根系分泌物及其所含的有機(jī)酸，但是拮抗菌對不同煙草品種的根系分泌物及其含有的有機(jī)酸的趨化程度各不相同。其中，GZYCT-4對紅花大金元根系分泌物有較強(qiáng)的趨化反應(yīng)，是其對K326 根系分泌物趨化反應(yīng)程度的兩倍左右；而GZYCT-9 對K326 根系分泌物的趨化反應(yīng)大于紅花大金元根系分泌物。

圖4 不同煙草品種根系分泌物的有機(jī)酸液相色譜圖Fig. 4 The HPLC chromatograms of organic acids in root exudate of different tobacco varieties

兩種煙草根系分泌物含的草酸、蘋果酸、檸檬酸及琥珀酸等四種有機(jī)酸中，草酸對GZYCT-4 的吸引作用最大，達(dá)到了61.50×105 cfu/mL，檸檬酸的影響次之，對GZYCT-4 吸引作用最弱的則是琥珀酸，僅為9.80×105cfu/mL；與此同時，對GZYCT-9吸引作用最大的是檸檬酸，達(dá)到了34.00 ×105cfu/mL，草酸的影響次之，而吸引作用最弱的則是琥珀酸，GZYCT-9 對其呈現(xiàn)負(fù)趨化反應(yīng)。此外，由對照處理組可以看出，雖然GZYCT-4 的游動性明顯低于GZYCT-9，但是GZYCT-4 對4 種酸的響應(yīng)程度則遠(yuǎn)高于GZYCT-9。

圖5 GZYCT-4 和GZYCT-9 菌對煙草根系分泌物和有機(jī)酸的趨化反應(yīng)Fig. 5 Chemotactic response of GZYCT-4 和GZYCT-9 to root exudates and organic acids

3 討論

具有生防能力的芽孢桿菌在國內(nèi)外均有大量報(bào)道，其在多種植物體內(nèi)以及根際土壤等生態(tài)環(huán)境中廣泛存在[14-15]。生防芽孢桿菌不僅產(chǎn)生多種抗菌蛋白及脂肽類物質(zhì)[16]，還可以促進(jìn)作物生長，誘導(dǎo)作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。因其具有防病效果好、對人畜安全和無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)而受到重視。目前，芽孢桿菌屬中的一些微生物如多粘類芽孢桿菌已被我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為免做安全鑒定的一級菌種[17]。本試驗(yàn)所獲得的2株對煙草青枯病菌具有較好拮抗作用的生防芽孢桿菌GZYCT-4 和GZYCT-9 分離自貴州地區(qū)的健康煙草根際土壤中，有效避免了有益微生物對環(huán)境的不適應(yīng)性，保證了拮抗微生物的防治效果。將其接種至K326 和紅花大金元煙株根際土壤，可顯著降低煙草青枯病病情指數(shù)，防治效果和農(nóng)用鏈霉素?zé)o明顯差異。該結(jié)果與吳秉奇等[18]、劉艷霞[19]的研究相一致，表明從煙草根際土壤中分離微生物是獲得生防菌的一種切實(shí)可行的方法。

芽孢桿菌作為重要的生物防治資源，其可通過[20]產(chǎn)生水解酶、抗菌脂肽等多種胞外代謝物質(zhì)導(dǎo)致植物病原真菌菌絲畸形、原生質(zhì)濃縮以及抑制抱子萌發(fā)[3]。已有大量研究報(bào)道芽孢桿菌屬微生物通過非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素能夠有效地控制植物病害，被認(rèn)為是芽胞桿菌防治植物病害的重要機(jī)制之一[21]。目前已有許多關(guān)于芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)防治植物病害的研究[22-23]。芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽主要包括表面活性素（surfactin）、枯草菌素（subtilin）、伊枯草菌素（iturins）、豐原素（fengycins）等[21,24]，伊枯草菌素和豐原素以其強(qiáng)烈的抗菌作用，可直接應(yīng)用于植物病害的生物防治[4]；生物表面活性素雖無直接抗菌能力，但是可以加強(qiáng)伊枯草菌素等脂肽抗菌能力，并且生物表面活性素還能在植物的根部形成一層生物膜（biofilm），該膜能保護(hù)植物根部免受病原菌的入侵[25]。本研究獲得的兩株芽孢桿菌GZYCT-4 和GZYCT-9 均能擴(kuò)增到細(xì)菌素（bmyB）、芬芥素（fenD）、伊枯草菌素（ituC）、表面活性素（srfAA、srfAB）等這些生防功能基因的目的片度，表明兩個菌株均具有產(chǎn)生芽孢桿菌生防標(biāo)記的潛能；且通過酸沉淀法獲得的兩株拮抗菌的脂肽類粗提物對煙草青枯病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，這一結(jié)果暗示了GZYCT-4 和GZYCT-9 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在生物防治領(lǐng)域可能的應(yīng)用潛力。但芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)種類較多，菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 對煙草青枯病菌的抑菌作用是多種脂肽類物質(zhì)共同作用的結(jié)果，還是單一脂肽類物質(zhì)的防病作用，仍需做進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。

生防細(xì)菌要充分發(fā)揮其在防治植物病害中的作用，接種至土壤中的菌株能否在植物根際有效定殖對其作用的發(fā)揮至關(guān)重要[26]。通常，具有較強(qiáng)根際定殖能力的微生物都能很好的利用植株根系分泌物，適應(yīng)植物的根際環(huán)境。細(xì)菌趨化性和生物膜形成能力已被認(rèn)為是評判生防細(xì)菌定殖能力的兩個重要指標(biāo)[26-27]。趨化性作為生防細(xì)菌定殖過程中的重要步驟，主要通過對植物根系分泌物中特定物質(zhì)的響應(yīng)而實(shí)現(xiàn)[27]。研究發(fā)現(xiàn)，植株可分泌各種各樣的糖、有機(jī)酸和次生代謝產(chǎn)物來調(diào)控根際微生物[28]，影響細(xì)菌在根際的趨化性和定殖能力，如Zhang 等人[29]發(fā)現(xiàn)B. subtilis N11 對香蕉根系分泌物的響應(yīng)能力要顯著的高于B.amyloliquefaciensSQR 9；擬南芥根系提取物和碳水化合物能顯著影響芽抱桿菌胞外多聚物（EPS）合成基因的表達(dá)，從而影響芽抱桿菌的生物膜形成能力[30]。研究結(jié)果顯示GZYCT-4 和GZYCT-9 均可利用紅花大金元和K326 兩種煙草品種的根系分泌物，但是對不同煙草品種的分泌物趨化能力則不相同。GZYCT-4 對紅花大金元根系分泌物有較強(qiáng)的趨化反應(yīng)，而GZYCT-9 則對K326 根系分泌物有較好的趨化反應(yīng)，說明GZYCT-9 較GZYCT-4更易在煙草K326 品種上定殖，而GZYCT-4 在紅花大金元煙草植株根際的定殖能力較強(qiáng)，這與試驗(yàn)過程中拮抗菌株GZYCT-4 和GZYCT-9 盆栽控病試驗(yàn)結(jié)果相符合。進(jìn)一步的研究顯示，GZYCT-4 對草酸、蘋果酸、檸檬酸及琥珀酸等四種有機(jī)酸均具有正趨化性，其中，對草酸的趨化反應(yīng)較強(qiáng)；而GZYCT-9則對煙草根系分泌物中的草酸、檸檬酸和蘋果酸等三種有機(jī)酸均具有正趨化性，且對檸檬酸的趨化反應(yīng)較大，究其原因，可能是有機(jī)酸中的諸如檸檬酸、蘋果酸等多為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，其可作為能源或信號物質(zhì)影響生防細(xì)菌自身的三羧酸循環(huán)[31]，從而表現(xiàn)為生防菌對檸檬酸、蘋果酸及草酸的趨化，此外，GZYCT-9 對煙草根系分泌物中的琥珀酸呈現(xiàn)負(fù)趨化作用，說明琥珀酸對于GZYCT-9 在煙草根際的定殖存在抑制作用。該試驗(yàn)結(jié)果初步明確了煙草根系分泌物及其含的有機(jī)酸對拮抗菌在煙草根部定殖的影響機(jī)制，為后期生防菌株的田間施用提供了一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從貴州省發(fā)病煙區(qū)的健康煙株根際土壤中分離純化獲得的GZYCT-4 和GZYCT-9 菌株，均為貝萊斯芽孢桿菌，對煙草青枯病菌具有較好拮抗作用，其抑菌圈直徑分別為16.64 mm 和18.90 mm。兩株煙草根際拮抗細(xì)菌施用到不同的煙草品種上，均能有效地防控?zé)煵萸嗫莶。档推浒l(fā)病程度，且GZYCT-4 對紅花大金元根系分泌物及其含有的草酸有較強(qiáng)的趨化反應(yīng)，而GZYCT-9 則對K326 根系分泌物及其含有的檸檬酸有較好的趨化反應(yīng)。