劉曉涵，張曉帆，李雪利，王靜，姚鵬偉，張勝，徐亮，葉協(xié)鋒

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2 中國煙草總公司職工進(jìn)修學(xué)院，鄭州 450002；3 湘西自治州煙草公司，湖南吉首 416000

土壤鹽漬化在世界范圍內(nèi)普遍存在，它已經(jīng)成為人們不得不面對的生態(tài)問題[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)的鹽漬土壤面積約為9.54 億公頃，我國鹽漬土壤面積約3460 萬公頃，占可耕地面積的1/3，且主要分布在東北、華北、西北內(nèi)陸地區(qū)以及長江以北沿海地帶[1]。土壤鹽漬化是一個(gè)漸進(jìn)的過程，化肥用量增加、不合理的灌溉，致使土壤次生鹽漬化狀況愈來愈重[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，河南12 個(gè)植煙區(qū)已經(jīng)有部分出現(xiàn)次生鹽漬化現(xiàn)象[4]；趙莉[5]對比了2006 年和2009年湖南植煙土壤鹽分含量，發(fā)現(xiàn)2009 年該地區(qū)植煙土壤出現(xiàn)鹽分表聚現(xiàn)象；石紅麗[6]也表示湖南植煙土壤鹽分表聚現(xiàn)象嚴(yán)重。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，湖南植煙區(qū)SO42-、NO-3、Ca2+、K+和Na＋在土壤表層積累較多[7]；而在內(nèi)陸鹽堿地，特別是松嫩平原，堿性鹽NaHCO3和Na2CO3大量存在[8]。

在鹽漬土壤中，部分土壤由于存留較多的NaHCO3等堿性鹽，導(dǎo)致土壤pH 升高，造成的土壤堿化問題比由NaCl 和Na2SO4等中性鹽造成的土壤鹽化問題更為嚴(yán)重[9]。在鹽堿脅迫下，植物的吸水能力減弱，葉綠素含量降低，光合作用受到影響，且隨著鹽堿濃度增大和脅迫時(shí)間延長，抑制作用愈發(fā)明顯[10]，而抗氧化酶活性和根系活力在低濃度脅迫時(shí)有增高趨勢，脅迫濃度升高，均表現(xiàn)降低趨勢[11]，此外，鹽堿脅迫造成的高pH 會影響植物根系對礦質(zhì)元素的吸收，阻礙離子穩(wěn)態(tài)的重建[12]。

近些年人們對鹽堿脅迫的研究越來越廣泛，但多數(shù)仍集中于對鹽脅迫或鹽脅迫與堿脅迫的比較方面[13-15]，關(guān)于煙草對復(fù)合鹽堿的生理響應(yīng)方面研究相對較少。因此本文以復(fù)合鹽堿溶液模擬鹽堿環(huán)境，探索不同鹽堿脅迫下煙草幼苗的生理代謝反應(yīng)機(jī)制，為今后相關(guān)方面研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2017 年5～7 月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地進(jìn)行。選取耐鹽能力較弱的中煙100[16]進(jìn)行漂浮育苗，按照正常育苗管理辦法進(jìn)行加肥（種子由青島中煙種子有限責(zé)任公司提供；煙草漂浮育苗專用基質(zhì)由山東數(shù)能信息科技有限公司提供；煙草漂浮育苗專用化肥由許昌科宏工貿(mào)有限公司提供），施加人工光源進(jìn)行培養(yǎng)，光強(qiáng)為1500～1800 Lux，光照時(shí)長為13 h/d，相對濕度70%～75%。培育40 d 后選擇長勢均勻一致的煙苗，用蒸餾水培養(yǎng)3 d后，將裝有煙苗的育苗盤放到不同質(zhì)量濃度的復(fù)合鹽堿溶液中進(jìn)行處理（每個(gè)處理保留120 株煙苗，且在處理的16 d 內(nèi)不加肥），復(fù)合鹽堿為n（NaCl）：n（Na2SO4）：n（NaHCO3）=1 :1 : 1，共設(shè)CK（蒸餾水）、T1（0.3%）、T2（0.6%）、T3（0.9%）和T4（1.2%）五個(gè)處理，每天上午9:00 測定鹽溶液電導(dǎo)率并補(bǔ)充蒸餾水以保證鹽濃度穩(wěn)定，4 d 換一次水，處理后0 d、4 d、8 d、12 d、16 d 取樣，每個(gè)指標(biāo)使用3 株煙苗，并重復(fù)3 次進(jìn)行測定。各鹽堿處理的鹽分濃度與組成及對應(yīng)的電導(dǎo)率值、pH 值見表1。

表1 復(fù)合鹽堿處理的鹽分組成與pHTab. 1 Salt composition and pH of compound saline-alkali treatment

1.2 測定項(xiàng)目及方法

每個(gè)處理選取具有長勢均勻一致的煙苗，保留除心葉外自上而下數(shù)的第一片葉和第二片葉，剪碎混勻后測定以下指標(biāo)。葉片相對含水率采用鮮重法[17]，葉綠素采用乙醇提取研磨法[17]，細(xì)胞膜透性采用Lutts 等[18]的方法，脫落酸（ABA）、和玉米素核苷（ZR）參照酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)測定[19]，丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法[17]，脯氨酸采用磺基水楊酸法[17]，可溶性糖采用蒽酮法[17]，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑 （NBT）法[17]，過氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法[17]。

處理后0 d、4 d、8 d、12 d、16 d，每個(gè)處理選取具有代表性的3 株煙苗，沿莖基部將根與莖分離，根系活力采用TTC 法[18]；將根系清洗干凈，盡量保證根系不斷裂破損，利用掃描儀（V700 Epson）掃描根系圖像，再用Win RHIZO PRO 2007 根系分析系統(tǒng)軟件（Regent Instruments Inc8，Canada）分析根系形態(tài)學(xué)參數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Microsoft Excel 2010 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗根系的影響

從試驗(yàn)第8 d 各處理根系掃描圖（圖1）可以看到，處理間根系生長已表現(xiàn)出較明顯差異，隨復(fù)合鹽堿濃度的增大，各處理根的數(shù)目逐漸減少，脅迫作用逐漸增強(qiáng)。

圖1 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗根系形態(tài)的影響Fig. 1 Effects of compound saline-alkali treatment on root morphology of tobacco seedlings

圖2 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗根系指標(biāo)的影響Fig. 2 Effect of compound saline-alkali treatment on root indicators of tobacco seedlings

由圖2 可知，隨著鹽堿濃度的逐漸增大，煙苗總根長呈逐漸降低趨勢，T4 煙苗根長在處理時(shí)間內(nèi)均表現(xiàn)為最短。各處理根表面積呈先增后降趨勢，低濃度處理（T1）在8～12 d 時(shí)表現(xiàn)出最大的根表面積，達(dá)31.18 cm2，濃度進(jìn)一步增大抑制了根表面積的增加。根尖數(shù)的變化較為明顯，T1 對根尖數(shù)有促進(jìn)作用，T2 對根尖數(shù)有輕微抑制，而T3、T4 處理的根尖數(shù)隨著處理時(shí)間延長先快速增加又快速下降，表明根尖對高鹽堿處理較敏感。CK 和T1 處理根系活力隨時(shí)間延長緩慢升高，T2、T3 和T4 處理的根系活力則呈緩慢下降趨勢，且有較明顯的差異，其中處理T1的根系活力在處理后12 d 達(dá)到最大值336.04 μg/（g·h），其他處理均低于CK，且始終保持T2＞T3＞T4 的狀態(tài)；CK 的根系活力持續(xù)增大，在16 d 時(shí)達(dá)到最大值384.41 μg/（g·h）。

2.2 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗葉綠素含量的影響

從表2可知，各處理葉綠素含量隨時(shí)間延長呈“∧”變化，且在16 d 時(shí)，CK 處理的各項(xiàng)葉綠素指標(biāo)均為最高；其中各處理葉綠素a含量均在第8 d達(dá)到最大值，隨后表現(xiàn)為鹽堿濃度越大，葉綠素a 含量越低；而葉綠素b 含量表現(xiàn)與葉綠素a 略有不同，T1 處理葉綠素b 含量在0～4 d 時(shí)高于CK，在12 d～16 d，各處理葉綠素b 含量和葉綠素總量均表現(xiàn)為CK＞T1＞T2＞T3＞T4；對比各處理葉綠素a/b 發(fā)現(xiàn)，處理T1、T2 葉綠素a/b整體先升后降，且在處理12 d 前均高于CK，但差異不顯著；其他處理葉綠素a/b 隨時(shí)間延長呈逐漸下降趨勢，處理16 d 時(shí)T4 葉綠素a/b 上升至1.85。

2.3 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗葉片相對含水率的影響

由圖3 可知，T1、T2、T3 和T4 處理的相對含水率均隨處理時(shí)間延長和處理濃度增加而降低，在第4 d 下降明顯，T4 由85.67%降至72.56%；處理后第16 d，T1 的相對含水率為71.33%，較CK 下降16.71%，而此時(shí)T4 僅為54.64%，葉片不能維持正常的生理狀態(tài)。

圖3 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗葉片相對含水率的影響Fig. 3 Effects of compound saline-alkali treatment on relative moisture content of leaf of tobacco seedlings

表2 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗葉綠素含量的影響Tab. 2 Effects of compound saline-alkali treatment on chlorophyll content in tobacco seedlings

2.4 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗葉片細(xì)胞膜透性及抗氧化酶的影響

由圖4a 可知，隨著復(fù)合鹽堿濃度的增大，煙草幼苗葉片細(xì)胞膜相對電導(dǎo)率不斷增加，即細(xì)胞透性逐漸增大；在4 d 時(shí)處理T1 的相對電導(dǎo)率較CK 低，未達(dá)到顯著水平，處理后8～12 d，各處理相對電導(dǎo)率逐漸上升且顯著高于對照處理，T4 更是在12 d 達(dá)到了85.23%；處理16 d 時(shí)，各處理電導(dǎo)率變化趨于平緩，T4＞T3＞T2＞T1＞CK。MDA 含量變化與細(xì)胞膜透性大致相同，即處理濃度越大，時(shí)間越長，MDA 含量越高，處理后16 d 時(shí)，復(fù)合鹽堿處理中T1 和T2 變化較慢，T3 和T4 持續(xù)增大，分別達(dá)到52.35 和59.24 nmol/g（圖4b）。

由圖4c-d 可知SOD 酶活表現(xiàn)為CK 和T1 變化波動相對較小，T2、T3 和T4 先升后降，在處理后第8 d，T4 處理SOD 酶活達(dá)到最高，為171.06 U/（g·h），其他鹽堿處理呈下降趨勢。CAT 活性的變化趨勢與SOD 相似，但處理間差異變化更大且前期反應(yīng)更為迅速，處理后0～8 d，各處理均呈上升趨勢，第8 d各鹽堿處理達(dá)到最大值，此時(shí)T4＞T3＞T2＞T1＞CK，隨時(shí)間增加，鹽堿處理的CAT 活力開始降低，第16 d 各處理間已無明顯差異。

2.5 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

圖4 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗葉片細(xì)胞膜透性及抗氧化酶的影響Fig. 4 Effects of leaf saline-alkali treatment on cell membrane permeability and antioxidant enzymes of tobacco seedlings

圖5 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響Fig. 5 Effects of compound saline-alkali treatment on soluble sugar and proline contents in tobacco seedling leaves

由圖5 可知，4 d 時(shí)隨著復(fù)合鹽堿濃度的增大，可溶性糖含量呈增加趨勢；處理后4～8 d，處理T4 逐漸下降，其他處理逐漸升高；處理后第12 d，T4 快速下降至0.81%，其他處理緩慢上升；處理后12～16 d，各處理均有下降趨勢，T3 和T4 均低于CK。脯氨酸含量的變化趨勢，除CK 持續(xù)升高外，其他處理先升后降。復(fù)合鹽堿脅迫4 d 后，各處理脯氨酸含量均有一定增長，且均高于對照；8 d 時(shí)，處理間脯氨酸含量為T4＞T3＞T2=T1＞CK；處理后第12 d，除T4 外，其他處理持續(xù)升高；處理后12～16 d，除CK 略有上升外，其他均呈下降趨勢。

2.6 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗根尖ABA 和ZR 含量的影響

由圖6 可知，復(fù)合鹽堿處理下根尖ABA 含量變化相對平緩，主要集中在20～40 ng/g。處理后第4 d，處理T1 和T2 有所下降，CK、T3 和T4 均隨時(shí)間延長而升高；處理12～16 d，T1 和T2 根尖的ABA 含量有所下降，T3、T4 則急劇上升，第16 d 分別達(dá)到50.00 和57.29 ng/g，較對照增加71.35%和96.33%。鹽堿處理下根尖ZR 含量變化波動較大，處理后第4 d，各鹽堿處理根尖ZR 含量快速升高，且均高于CK；處理后第8 d，處理T1 根尖ZR 含量達(dá)到最高值，為9.75 ng/g，且各鹽堿處理均高于CK；處理后8～12 d，處理T1 和T2 根尖ZR 含量逐漸下降；12 d 時(shí)處理T3 達(dá)到最大值，為12.56 ng/g；處理后16 d，CK 高于各鹽堿處理。

圖6 復(fù)合鹽堿處理對煙草幼苗根尖ABA 和ZR 含量的影響Fig. 6 Effects of compound saline-alkali treatment on ABA and ZR contents in root tip of tobacco seedlings

3 討論

根系的生長存在很大的可塑性，它能夠通過改變形態(tài)與分布來適應(yīng)不利環(huán)境，在鹽堿脅迫下根部是面對脅迫的首要部位。所以根的生長發(fā)育狀況和活力對植物的耐鹽能力至關(guān)重要[20]。本研究發(fā)現(xiàn)在輕度鹽堿脅迫下，煙苗總根長相對CK 變短，可能是煙苗根系為減少Na+的吸收而做出的適應(yīng)性變化[21]，在鹽堿處理12 d 時(shí)，特別是T3、T4 的許多根尖由白嫩變褐腐爛，16 d 時(shí)這種情況更加普遍，可能是長期高鹽堿環(huán)境導(dǎo)致幼嫩的分生組織壞死，不能持續(xù)生長[22]。同時(shí)鹽堿處理降低了煙苗的根系活力，這可能是鹽堿環(huán)境中高pH 所產(chǎn)生的抑制作用，丁俊男等[23]試驗(yàn)也證明了根活與pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)。該處理根系的變化趨勢與前期所做復(fù)合鹽處理?xiàng)l件下變化趨勢大致相似。鹽分積聚造成根際的高滲透勢，使得根系的礦質(zhì)營養(yǎng)狀況及氧氣供應(yīng)能力嚴(yán)重破壞，而較高的pH 又迫使根系合成并積累大量的有機(jī)酸，因此導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子失衡、代謝紊亂，最終植物根系生長受到破壞[24]。

鹽堿脅迫對根系的生長發(fā)育造成破壞，影響了營養(yǎng)物質(zhì)向地上部的運(yùn)輸，進(jìn)而造成地上部分生長受抑制，光合作用受到影響[25]。本文研究表明在0～8 d 時(shí)，T1 處理的葉綠素含量高于CK，這可能是在鹽堿脅迫下葉綠素合成前體物δ-氨基酮戊酸（ALA）、膽色素原（PBG）和尿卟啉原Ⅲ（Uro Ⅲ）大量積累[26]，促進(jìn)了葉綠素的合成；而在8～12 d，隨著鹽堿濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b 的含量和葉綠素a/b 逐漸下降，這可能是鹽堿脅迫引起了葉綠素的降解[27]，同時(shí)葉綠素比例發(fā)生變化[28]所致；薛延豐等[29]認(rèn)為鹽堿脅迫造成的葉綠素含量下降可能是堿性鹽脅迫破壞了細(xì)胞微環(huán)境的酸堿平衡，影響葉綠體類囊體兩側(cè)H+濃度梯度的建立，從而降低了葉綠體中ATP 合成的動力。對于試驗(yàn)中處理后16 d 部分處理葉綠素升高的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)槊{迫時(shí)間越長，植株代謝紊亂越嚴(yán)重，導(dǎo)致葉片葉綠素與蛋白間的結(jié)合變得松弛，使得在測定中葉綠素更容易被提取，從而造成復(fù)合鹽堿處理的葉綠素含量有升高趨勢[30]。在復(fù)合鹽脅迫與復(fù)合鹽堿脅迫下，煙草幼苗的葉綠素含量均減少，與前期復(fù)合鹽試驗(yàn)數(shù)據(jù)相比，在相同離子濃度情況下，復(fù)合鹽堿脅迫處理的煙草幼苗葉綠素含量降幅更大。

本試驗(yàn)中鹽堿處理的可溶性糖和脯氨酸含量的變化與葉綠素的變化規(guī)律相似，均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，這是由于脯氨酸的合成有賴于碳水化合物通過氧化磷酸化作用提供的氫和還原能力[31]，長時(shí)間鹽堿作用下導(dǎo)致光合能力受到抑制，提供還原能力減弱，導(dǎo)致后期脯氨酸含量下降；同時(shí)ABA 可以促進(jìn)脯氨酸的合成，影響細(xì)胞內(nèi)H+分泌，改變細(xì)胞液內(nèi)酸堿平衡，這也是脯氨酸含量變化波動較大的原因[24,32]。同時(shí)與復(fù)合鹽處理結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，復(fù)合鹽堿傷害更大，在復(fù)合鹽處理下，可溶性糖和脯氨酸含量呈上升趨勢；在復(fù)合鹽堿脅迫條件下隨著濃度的增大，兩種物質(zhì)含量在某一濃度達(dá)到峰值后，呈現(xiàn)下降趨勢，表明鹽堿脅迫能使煙苗更早達(dá)到耐鹽閾值，進(jìn)而導(dǎo)致其滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡。

周瑞蓮等[33]指出植物細(xì)胞中水分狀況與有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物多少有關(guān)，水分狀況良好時(shí)，將更多光合產(chǎn)物用于生長，限制有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物的合成及可溶性糖向根輸入；在細(xì)胞缺水時(shí)，則促使脯氨酸和可溶性糖等有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物合成含量增加。本文研究結(jié)果顯示，鹽堿處理的煙苗葉片含水率隨著時(shí)間延長逐漸降低，葉片缺水可能是有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物合成的另一誘因。從這兩種物質(zhì)含量的變化可以看出短期脅迫下植物應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng)，而長時(shí)間處于脅迫狀態(tài)，植物抗鹽堿能力逐漸降低。

許多研究指出激素對植物抗逆性的調(diào)節(jié)不依賴于單一激素的絕對含量，是各類激素達(dá)到一個(gè)動態(tài)平衡狀態(tài)[29]。本研究結(jié)果顯示隨著處理時(shí)間的延長，煙草幼苗體內(nèi)ABA 含量呈波動式增長，這與前期復(fù)合鹽處理試驗(yàn)結(jié)果變化趨勢和劉磊[34]研究鹽堿脅迫下甜菜苗期的結(jié)果相似，可能是脅迫條件下，植物體內(nèi)維持ABA 與ZR 的平衡，控制氣孔開閉，改變?nèi)~片氣孔阻力，從而減少水分蒸發(fā)抵御高鹽脅迫[35～36]。從結(jié)果來看，初期脅迫誘導(dǎo)植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，根部抗逆能力增強(qiáng)，合成ZR增多，與前期進(jìn)行的鹽脅迫相比，增幅更加明顯。隨脅迫時(shí)間的增長，分生組織細(xì)胞膜受到破壞，合成功能受阻[30]。

綜上所述，煙草幼苗在低濃度的復(fù)合鹽堿處理下根系發(fā)育狀況良好，葉片合成葉綠素可維持正常代謝，自身的滲透調(diào)節(jié)、激素及相關(guān)酶系統(tǒng)仍處于動態(tài)平衡狀態(tài)。隨著脅迫程度的增加，根系發(fā)育遲緩，葉綠素含量和葉片含水率有降低趨勢，而細(xì)胞膜不同程度受損，體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成增多，激素含量變化較大，煙苗生長受阻。然而在復(fù)合鹽堿處理下，不同生育期的煙株生理代謝狀況會有哪些變化，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低濃度的復(fù)合鹽堿處理在一定程度上促進(jìn)葉綠素合成，且短時(shí)低鹽堿脅迫對根表面積及根活等有不同程度的促進(jìn)；高濃度、長時(shí)間的復(fù)合鹽堿脅迫會對煙草幼苗細(xì)胞膜、葉綠素及根系造成損傷，且濃度越大、時(shí)間越長抑制效果越明顯。

遭受脅迫后，煙草幼苗的內(nèi)源激素、有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗氧化酶系統(tǒng)均在短期內(nèi)做出了響應(yīng)。隨著處理濃度的增加和時(shí)間的延長，根系生長受阻，葉綠素含量逐漸下降，ABA、可溶性糖和脯氨酸含量均呈下降趨勢，植物體內(nèi)的代謝紊亂。