馮 哲劉 娣馮艷忠胡寶忠4*李鳳蘭*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150000;2.遼寧省本溪市農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心,遼寧本溪117000;3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,黑龍江哈爾濱150000;4.哈爾濱學(xué)院,黑龍江哈爾濱150000)

我國是一個農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國,秸稈資源豐富,但其實(shí)際利用率相對較低[1-4]。秸稈中纖維素含量最多[5]。纖維素是世界上量最大的一類可再生、可生物降解的能量物質(zhì)[6],但是纖維素中復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會明顯降低纖維素酶的可及性,再加上一些環(huán)境因素如溫度的影響,從而使纖維素的利用率很低。目前,天然纖維素的水解技術(shù)有酸水解、酶水解和微生物水解三種。其中酸水解和酶水解都存在一定的缺點(diǎn)和安全問題,很難實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用,阻礙其推廣應(yīng)用[7-10]。但微生物水解纖維素是一種綠色高效、成本較低的方法,已經(jīng)從當(dāng)初為了預(yù)防微生物破壞天然纖維素的研究目的轉(zhuǎn)為微生物對廢棄纖維的降解,如花生殼、麥稈等。

膨脹素是存在于植物細(xì)胞壁中的一種蛋白[11-12],而這種蛋白在部分微生物細(xì)胞壁中也存在,其于1989年被Cosgrove等首次發(fā)現(xiàn)[13],它可以在不水解共價鍵的情況下,破壞纖維素復(fù)雜結(jié)構(gòu)中的氫鍵網(wǎng)絡(luò),引起細(xì)胞壁上的聚合體發(fā)生滑動,使細(xì)胞壁松弛延伸,能與纖維素酶協(xié)同降解纖維素[14],是一種對植物和部分微生物整個生長發(fā)育過程都有重要意義的一種協(xié)同蛋白。若能對膨脹素合理利用,通過膨脹素與纖維素酶協(xié)同水解纖維素來提高纖維素的降解效率,就可能解決纖維素降解難的問題,起到很重要的現(xiàn)實(shí)意義。

此前,研究者們對重組膨脹素與纖維素酶一起協(xié)同水解纖維素的作用研究均是在常溫或高溫條件下進(jìn)行的[15-17],然而,在低溫條件下重組膨脹素與纖維素酶一起協(xié)同水解纖維素的研究鮮有報道。李飛等[18]利用低溫處理小麥根部,發(fā)現(xiàn)膨脹素基因TaEXPA5、TaEXPA6、TaEXPA7在低溫脅迫下,相對表達(dá)量顯著性升高。本研究以東農(nóng)冬麥1號的膨脹素基因EXPB7為供體,構(gòu)建黑曲霉表達(dá)載體,以黑曲霉CICC2462為受體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化黑曲霉,構(gòu)建膨脹素基因的黑曲霉工程菌;并對該工程菌的發(fā)酵液纖維素水解作用進(jìn)行分析,為纖維素酵解提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EXPB7基因的載體 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;Trans5α感受態(tài)pEASY-T3載體 購自北京全式金生物;AGL1農(nóng)桿菌感受態(tài) 北京博邁德生物;黑曲霉CICC2462表達(dá)載體pSZHGS(含有T3-EXPB7) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)試驗(yàn)室提供;限制性內(nèi)切酶(NheI、HindIII)、T4 DNA連接酶 NEB公司。

多功能低溫臺式離心機(jī) 杭州奧盛儀器有限公司;ZHWY-2102C全溫度恒溫?fù)u床 江蘇盛藍(lán);電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HZQ-C空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;ZHWY-100B經(jīng)典型多振幅搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;HWS-28型恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;CJ-2D型超凈工作臺 泰斯特;高速離心機(jī)、Mini-6K微型離心機(jī) 杭州奧盛儀器有限公司;WFH-210B紫外投射反射儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;SmartGel一體化凝膠成像儀 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;DYY-8C型電泳儀、DYY-III型水平電泳槽、DYCZ-24DN型垂直電泳槽 北京市六一儀器廠;實(shí)時熒光 PCR儀 杭州博日科技有限公司;PB-10型酸度計(jì) Sartorius;P330型超微量分光光度計(jì) Implen GmbH;紫外分光光度計(jì) 德國貝克曼;超微量微孔板分光光度計(jì) BioTek Epoch。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶NheI和HindIII對T3-EXPB7進(jìn)行雙酶切,電泳后分別回收大約750 bp左右的目的條帶;同時使用相同的酶對表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切,回收大約15000 bp左右的條帶[19];膠回收方法參照北京全式金膠回收試劑盒說明書。用超微量分光光度計(jì)測定膠回收產(chǎn)物的濃度后按照3∶1～6∶1(目的基因∶表達(dá)載體)的摩爾比混勻,再加入T4 DNA連接酶,16 ℃過夜連接。載體構(gòu)建的示意圖如圖1所示。

將上一步過夜連接的產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)進(jìn)行擴(kuò)增,挑取長勢較好的菌落接到無菌的LB液體培養(yǎng)基中(含Kan 50 mg/L),37 ℃條件下培養(yǎng)12～16 h,然后進(jìn)行質(zhì)粒的提取,提取方法參照北京全式金質(zhì)粒小提試劑盒說明書,再將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,將鑒定正確的菌種用甘油保存至超低溫冰箱備用。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中,在培養(yǎng)平板中挑取長勢較好的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng),然后PCR鑒定。分別取出1.5 mL二次活化的農(nóng)桿菌菌液和黑曲霉菌絲到無菌EP管中,將二者按比例混勻后,涂布于鋪有玻璃紙的固體PDA培養(yǎng)基表面(含有200 μmol/L的AS),28 ℃共培養(yǎng)2 d后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜培養(yǎng),使用潮霉素和頭孢噻肟鈉作為抗性篩選,直到長出明顯的黑曲霉白色菌落。再挑取白色菌落的菌絲放入含有抗性的馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng),直到長出大量的黑曲霉菌絲。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉的步驟參見李杰等[19]方法。3～5 d后挑取平板上長勢良好的黑曲霉菌落菌絲,使用糖化酶同源臂引物F7/R7進(jìn)行PCR,進(jìn)行黑曲霉轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定,具體方法參見王欣等[20]方法。

采用以基因組DNA為模板,使用鑒定同源重組的引物F8/R8對篩選的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定,篩選出同源重組轉(zhuǎn)化子,所用的引物如表1所示。

圖1 pSZHGS-EXPB7的構(gòu)建Fig.1 Construction of pSZHGS-EXPB7

表1 陽性及同源重組轉(zhuǎn)化子鑒定引物Table 1 Primer sequence of positive and homologous recombinant transformants

1.2.3 純合子的篩選 由于該黑曲霉菌絲為多核,為了保證其穩(wěn)定遺傳,因此需要對同源重組轉(zhuǎn)化子加以篩選,直到獲得純合子。

將鑒定正確的同源重組轉(zhuǎn)化子在含有 200 mg/L潮霉素B的PDA和馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代,期間收集其黑曲霉菌絲進(jìn)行基因組的提取并進(jìn)行同源重組轉(zhuǎn)化子的鑒定,若獲得的轉(zhuǎn)化子中糖化酶基因條帶消失,只有一條目的條帶,則表明已獲得純合的同源重組轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 重組菌株轉(zhuǎn)錄水平的鑒定 將獲得的同源重組轉(zhuǎn)化子在馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培,按照10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,放入30 ℃搖床,200 r/min培養(yǎng)6 d左右。取出部分發(fā)酵液置于50 mL離心管中,將沉淀和上清分開,取部分沉淀進(jìn)行總RNA的提取,方法參照北京全式金RNA提取試劑盒說明書。

以黑曲霉的總RNA為模板,對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系和條件參照北京全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

為了鑒定轉(zhuǎn)入的膨脹素基因是否轉(zhuǎn)錄,需要以黑曲霉cDNA為模板,設(shè)置內(nèi)參作為對照,以確定cDNA的完整性,然后設(shè)計(jì)特異性較好的引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR,鑒定膨脹素基因是否轉(zhuǎn)錄。所用的引物如表2所示。

1.2.5 膨脹素蛋白的SDS-PAGE檢測 取少量發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE,檢測是否存在膨脹素蛋白,主要方法參照文獻(xiàn)[21]。

1.2.6 膨脹素蛋白的功能檢測

1.2.6.1 濾紙崩解試驗(yàn) 將單獨(dú)的纖維素酶液、出發(fā)菌株發(fā)酵液上清和重組菌株發(fā)酵液上清分別與0.1 mol/L pH為4.8的檸檬酸緩沖液等比例混合后,取5 mL倒入干凈的培養(yǎng)皿中,放入50 mg的定量濾紙后封口放入25 ℃溫箱靜置,2 d后取出濾紙放在顯微鏡下觀察其崩解程度。

表2 轉(zhuǎn)錄水平鑒定的引物Table 2 Primer sequence of identification in transcription level

1.2.6.2 還原糖含量的測定 由于濾紙中含有淀粉,而黑曲霉發(fā)酵液中含有淀粉酶,在測定還原糖時,為了避免試驗(yàn)結(jié)果受到影響,需要對濾紙預(yù)處理。方法如下:將濾紙剪成1 cm×6 cm的50 mg左右的濾紙條,用1%的醋酸溶液浸泡24 h,直到用碘液檢驗(yàn)確定沒有變藍(lán)后,再用2%的NaHCO3溶液沖洗至中性,置于烘箱烘干備用。

用重組菌株發(fā)酵液上清與稀釋酶液分別處理濾紙,加入纖維素酶保溫后以緩沖液為對照組,設(shè)3次重復(fù),采用DNS法測定其葡萄糖的增加量[22]。將重組菌株與稀釋酶液協(xié)同降解濾紙產(chǎn)生的葡萄糖含量和稀釋酶液降解濾紙產(chǎn)生的葡萄糖含量相比,計(jì)算葡萄糖的增加比例。

式中:C表示還原糖提取液的濃度,mg/mL;V表示還原糖提取液的總體積,mL;m表示樣品重量,g;1000表示mg換成g的系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過Excel錄入,并使用Excel對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理。利用GrapHPad Prism 5對初步處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。另外,利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉表達(dá)載體構(gòu)建

分別用限制酶對目的基因和空表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切,并用T4 DNA連接酶連接之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)繁;提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定,得到約15000和750 bp左右的兩條帶如圖2所示,表明黑曲霉表達(dá)載體pSZHGS-EXPB7已經(jīng)成功構(gòu)建。

圖2 雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion 注:M1:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)15000 bp;1:pSZHGS原質(zhì)粒;2:pSZHGS-EXPB7質(zhì)粒;3:pSZHGS-EXPB7質(zhì)粒雙酶切;M2:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000 bp。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉及轉(zhuǎn)化子鑒定

2.2.1 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的鑒定 將構(gòu)建好的重組載體pSZHGS-EXPB7采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,液體培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定,電泳圖譜如圖3所示。從圖3中可以看出約750 bp的單一條帶,條帶大小與預(yù)期的目的條帶大小基本一致。

圖3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定圖譜Fig.3 PCR identification map of Agrobacterium transformants注:M:Marker DL2000;1:EXPB7。

2.2.2 農(nóng)桿菌與黑曲霉共培養(yǎng) 取出二次活化的農(nóng)桿菌菌液和黑曲霉菌絲,將二者按比例混勻后,涂布于鋪有玻璃紙的固體PDA培養(yǎng)基表面(含有200 μmol/L的AS),28 ℃共培養(yǎng)2 d,共培養(yǎng)的結(jié)果如圖4所示。

圖4 農(nóng)桿菌與黑曲霉共培養(yǎng)Fig.4 Co-culture of Agrobacterium tumefaciens and Aspergillus niger

2.2.3 黑曲霉同源重組轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

2.2.3.1 轉(zhuǎn)化子的鑒定 挑取平板上長勢良好的黑曲霉菌落菌絲進(jìn)行黑曲霉轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定,鑒定圖譜如圖5所示。由圖5可知,轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)鑒定已擴(kuò)增出了約4700和3000 bp的兩個目的條帶,4700 bp的條帶與黑曲霉出發(fā)菌株目的基因片段大小一致,3000 bp條帶出現(xiàn)則表明已經(jīng)成功獲得了EXPB7基因的陽性轉(zhuǎn)化子。用基因組DNA為模板,使用引物F8/R8進(jìn)行PCR鑒定,鑒定圖譜如圖6所示。由圖6中可以看出,該基因的陽性轉(zhuǎn)化子有部分?jǐn)U增出了約1701 bp的目的條帶,表明已經(jīng)成功獲得EXPB7基因的同源重組轉(zhuǎn)化子。

圖5 黑曲霉轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定圖譜Fig.5 PCR identification map of Aspergillus niger transformants注:M:Marker DL15000;1～6:EXPB7轉(zhuǎn)化子鑒定。

圖6 同源重組轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定圖譜Fig.6 PCR identification map of homologous recombination transformants注:M:Marker DL15000;1～6:EXPB7同源重組轉(zhuǎn)化子的鑒定。

2.2.3.2 純合子的篩選 將鑒定正確的同源重組轉(zhuǎn)化子連續(xù)傳代幾次進(jìn)行鑒定。由圖7可以看出獲得的轉(zhuǎn)化子含有4700 bp的條帶并未完全消失,未篩選到純合子,可能是因?yàn)楹谇篂槎嗪司z,雜合子在生長過程中由于無法與出發(fā)菌株競爭而退化。

圖7 EXPB7純合子的篩選Fig.7 Homozygous selection of EXPB7注:M:Marker DL5000;1～6:EXPB7純合子的篩選。

2.3 重組菌株轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的鑒定

通過PCR鑒定獲得的同源重組轉(zhuǎn)化子的目的基因是否轉(zhuǎn)錄,鑒定圖譜如圖8所示。由圖8可知,內(nèi)參引物擴(kuò)增出單一條帶,說明反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA比較完整;特異性引物擴(kuò)增出單一的約120 bp左右的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致,表明該膨脹素基因已經(jīng)在黑曲霉中成功轉(zhuǎn)錄。膨脹素蛋白的分子量經(jīng)過預(yù)測發(fā)現(xiàn),EXPB7的分子量約為28 kDa。取少量發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE,蛋白質(zhì)電泳圖譜如圖9所示,電泳后發(fā)現(xiàn)重組菌株與出發(fā)菌株相比,在相應(yīng)的位置附近有變化,但在28 kDa處的目的條帶不明顯,可能是由于膨脹素基因在黑曲霉中的表達(dá)量過低。

圖8 重組菌株的反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定Fig.8 Electrophoresis of reverse transcription PCR of recombinant strains

圖9 發(fā)酵液上清的蛋白質(zhì)電泳圖譜Fig.9 Map of protein electrophoresis of the supernatant of fermentation broth注:M:蛋白質(zhì)Marker;1:培養(yǎng)基上清;2:出發(fā)菌株發(fā)酵液上清;3:EXPB7重組菌株發(fā)酵液上清。

圖10 轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液上清對濾紙崩解的影響(40×)Fig.10 Effect of the supernatant of fermentation broth on the disintegration of filter paper(40×)注:A:纖維素酶;B:出發(fā)菌株發(fā)酵液上清+纖維素酶;C:EXPB7轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清+纖維素酶。

2.4 EXPB7蛋白的功能驗(yàn)證

2.4.1 濾紙崩解 其中出發(fā)菌株發(fā)酵液上清與纖維素酶共處理濾紙時,濾紙變化不大,說明出發(fā)菌株的分泌蛋白并沒有對濾紙崩解起明顯促進(jìn)作用。

2.4.2 還原糖含量變化 由濾紙崩解實(shí)驗(yàn)可知,出發(fā)菌株的分泌蛋白并沒有對濾紙的崩解起明顯促進(jìn)作用,所以,我們利用稀釋酶液和重組菌株發(fā)酵液上清對濾紙進(jìn)行處理,對產(chǎn)生的還原糖含量進(jìn)行測定,結(jié)果如圖11所示,與僅用酶液處理濾紙產(chǎn)生的葡萄糖含量相比,EXPB7能夠?qū)⒗w維素酶的水解效率提高32.9%,表明膨脹素蛋白可以提高纖維素酶的水解效率。

圖11 重組菌株上清處理濾紙還原糖含量變化Fig.11 Changes in reducing sugar content of filter paper treated with recombinant strains

3 討論與結(jié)論

迄今為止已經(jīng)有很多的外源蛋白在黑曲霉中成功表達(dá),黑曲霉具有高效的蛋白表達(dá)[23]、分泌和修飾能力及很強(qiáng)的外源基因表達(dá)能力,其重組子具有很高的遺傳穩(wěn)定性,它可生產(chǎn)木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶等多種酶,成為了一個重要的酶表達(dá)體系。許多研究者已經(jīng)證明了黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的活力高、產(chǎn)量大、酶功能完整、優(yōu)化程度高,用途十分的廣泛[24]。當(dāng)然,有些外源蛋白也可以通過巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),利用畢赤酵母構(gòu)建膨脹素工程菌,可有效分泌膨脹素,利用膨脹素具有破壞纖維素的結(jié)構(gòu)的能力,可有效地提高纖維素酶對纖維素的分解效率[25];構(gòu)建木聚糖酶工程菌,通過構(gòu)建游離型表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)與整合表達(dá)聯(lián)合應(yīng)用來強(qiáng)化木聚糖酶的分泌效率提高其酶活[26]。本試驗(yàn)用到的工程菌黑曲霉也可以提高木聚糖酶的活性,并且比畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)更有優(yōu)勢,其具有美國FDA認(rèn)證的GRAS食品級生產(chǎn)許可,為其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了質(zhì)量保障[24]。

膨脹素是植物生長發(fā)育過程中誘導(dǎo)細(xì)胞壁松弛和伸展的蛋白,破壞纖維素微纖絲之間氫鍵使纖維素結(jié)構(gòu)松散從而提高其酶解效率[27],有著潛在的應(yīng)用價值,但不具有纖維素水解活性[28]。膨脹素對纖維素結(jié)構(gòu)的破壞活性被認(rèn)為能促使酶更好的與底物結(jié)合從而與纖維素酶協(xié)同作用提高底物水解效率[29]。郭堯敏等[30]研究了水稻根特異表達(dá)的膨脹素基因OsEXPA8,該基因?qū)λ緫腋〖?xì)胞的生長具有調(diào)控作用,可以促進(jìn)水稻懸浮細(xì)胞的分裂和生長,使細(xì)胞數(shù)量增加,體積增大。姚楊[31]將里氏木霉膨脹素基因swol在黑曲霉中進(jìn)行表達(dá),重組的pSZHGS-swol菌株的發(fā)酵液上清能夠協(xié)同纖維素酶降解濾紙纖維,使其更加膨松并且有明顯的崩解效果,驗(yàn)證了該蛋白具有明顯的膨松濾紙纖維的作用。但其在研究該膨脹素基因在黑曲霉中表達(dá)時,目的條帶也不明顯,說明表達(dá)量過低不是個例。對于本研究中表達(dá)量不高的情況可以通過更換不同的分泌型表達(dá)載體的信號肽序列來優(yōu)化,也可以通過密碼子優(yōu)化方法使植物膨脹素基因的密碼子更換為偏好于黑曲霉的密碼子來優(yōu)化。黃莎莎等[25]將從黃瓜D0462中克隆的Cs-EXPA1基因和Cs-EXPA2基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中,EXPA1蛋白、EXPA2蛋白與纖維素酶的協(xié)同作用均可以使濾紙發(fā)生崩解,其水解協(xié)同效率與本研究協(xié)同效率相當(dāng)。

本研究將寒地冬小麥膨脹素基因EXPB7轉(zhuǎn)化到黑曲霉中進(jìn)行表達(dá),EXPB7轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清和纖維素酶共同作用,濾紙發(fā)生崩解現(xiàn)象明顯,水解葡萄糖含量增加,與預(yù)期效果一致。