郭彩霞1,韓 麗1,喬進(jìn)平1,張生萬1,李美萍1,李 娟

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;2.山西琪爾康生物制品有限公司,山西臨汾 041000)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們的生活方式開始發(fā)生改變,高脂高熱量飲食以及多坐少動的生活方式成為主流,導(dǎo)致肥胖發(fā)生率逐年上升。據(jù)世界衛(wèi)生組織2017年10月的報(bào)道,相比1975年,世界肥胖人數(shù)增長了約三倍[1]。與此同時(shí),肥胖的發(fā)生增加了患高血脂、非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化等慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn),已成為影響人們健康和生活質(zhì)量的重要因素之一。目前,減肥的方法主要有熱量限制結(jié)合運(yùn)動、藥物治療法等。其中熱量限制結(jié)合運(yùn)動的方法由于熱量攝入受限致使機(jī)體長期處于能量負(fù)平衡狀態(tài),從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生能量-節(jié)約機(jī)制,長期減肥效果不明顯[2]。而藥物治療雖然能有效控制體重增加,但是長期服用藥物可能會產(chǎn)生毒副作用。因此,食源性的功能食品在預(yù)防和治療肥胖中的作用已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注[3-4]。

翅果油(Elaeagnusmollisoil,EMO)是從翅果油樹種仁中提取的一種油脂,富含不飽和脂肪酸、維生素E、植物甾醇等,具有很好的降血脂、抗氧化及預(yù)防肥胖作用[5]。黃玲等對翅果油進(jìn)行抗氧化能力的研究,結(jié)果表明其抗氧化作用優(yōu)于單純維生素E,略強(qiáng)于沙棘油[6];陳雨娜發(fā)現(xiàn)翅果油有助于提高小鼠機(jī)體抗氧化能力和血脂調(diào)節(jié)能力[7];白誼涵等探討翅果油膠囊對高脂血癥患者血脂的影響及不良反應(yīng),結(jié)果顯示翅果油膠囊對高脂血癥患者血脂具有明顯的調(diào)節(jié)作用,且安全性和耐受性良好[8]。目前對于翅果油的功能性質(zhì)研究主要集中在改善血脂及抗氧化能力上,而對于翅果油預(yù)防肥胖作用方面的研究鮮有報(bào)道。本研究以C57BL/6小鼠作為受試動物,對翅果油干預(yù)對高脂飲食小鼠降脂減肥的作用進(jìn)行研究,以期為翅果油預(yù)防肥胖及相關(guān)疾病的作用提供理論依據(jù),為翅果油的開發(fā)與利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級4周齡的雄性C57BL/6小鼠(17～20 g) 南京君科生物工程有限公司,生產(chǎn)許可證編號:SCXK(蘇)2016-0010;翅果油 山西琪爾康翅果生物制品有限公司;基礎(chǔ)飼料 山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心;45%高脂飼料(D12451) 北京科澳協(xié)力飼料有限公司,生產(chǎn)許可證編號:SCXK(京)2014-0010;甘油三酯、總膽固醇、低密度膽固醇檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;總RNA提取試劑盒 天跟生化科技有限公司;UEIris RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis試劑盒、SYBR2×/Fast Super EvaGreen qPCR Master 蘇州宇恒生物科技有限公司;甲醛、蘇木精、伊紅、無水乙醇、二甲苯、硫酸鋁鉀、甘油、碘酸鈉等 均為分析純,山西吉泰禾試劑公司。

JA5003型分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;FYL-YS-50L型恒溫培養(yǎng)箱 北京福意電器有限公司;KDC-140HR型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;SynergyMx多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司;萊卡RM2255石蠟切片機(jī) 德國萊卡公司;ZKPJ-1A展烤片機(jī) 天津天利航空機(jī)電有限公司;CX31光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司;T100 PCR儀、電泳儀 美國伯樂BIO-RAD公司;ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與飼養(yǎng) 40只C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,動物飼養(yǎng)條件為:溫度20～26 ℃,濕度40%～60%,12 h光照12 h黑暗,小鼠自由攝食飲水。每天觀察小鼠基本狀態(tài),記錄每天小鼠攝食量,每周稱量體重,每3 d換一次墊料。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,隨機(jī)分為5組(n=8):正常組(Normal Diet group,ND)、高脂飲食組(High-fat Diet group,HFD)、翅果油低劑量組(Low-doseElaeagnusmollisoil group,LE)、翅果油中劑量組(Middle-doseElaeagnusmollisoil group,ME)和翅果油高劑量組(High-doseElaeagnusmollisoil group,HE)。ND組給予基礎(chǔ)飼料,HFD組給予45%高脂飼料,LE、ME、HE組給予45%高脂飼料并分別灌胃1.5、3.0、6.0 g/kg·d翅果油。灌胃劑量選取:根據(jù)2017中國居民膳食指南,人體每日推薦油脂攝入量為25 g,成人重按60 kg計(jì)算,即成人每日油脂攝入量為0.42 g/kg。灌胃劑量根據(jù)動物與人體等效劑量換算[9],且小鼠灌胃1.5、3.0、6.0 g/kg·d分別相當(dāng)于人體每日推薦量的0.5、1、2倍。正常組和高脂飲食組每天灌胃0.2 mL生理鹽水,灌胃時(shí)間為每天早上8:00,連續(xù)干預(yù)8周。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠自由采食和飲水,每天記錄小鼠的攝食量,計(jì)算在整個(gè)飼養(yǎng)過程中每日每只老鼠攝食量的平均值,并按照基礎(chǔ)飼料3.85 kcal/g、高脂飼料4.73 kcal/g和翅果油9.0 kcal/g乘以各自攝入量來計(jì)算攝入熱量。

1.2.2 樣品收集與處理 干預(yù)8周后,小鼠禁食不禁水12 h,皮下注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉(60 mg/kg)。摘眼球取血,采血完成后,迅速剝離脂肪組織用冰冷的生理鹽水清洗掉表面血水后用吸水紙擦干,稱重。選取脂肪組織中較規(guī)則部分,并切成立方體(1 cm×1 cm×0.5 cm)置于包埋盒中投入10%中性甲醛溶液中固定3周以上,避光保存,用于組織病理的觀察,其余組織置于液氮中速凍,并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠體重、體長和Lee’s指數(shù)測定 小鼠體重每周測一次;干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測小鼠體長(鼻尖到肛門的長度),按式(1)計(jì)算Lee’s指數(shù)。

式(1)

式中:L為小鼠體長(cm),m為小鼠體重(g)。

1.2.4 小鼠肝臟、血清生化指標(biāo)測定 將小鼠處死后,取肝臟根據(jù)試劑盒說明書測定TG、TC。

血液離心后,取上清液根據(jù)試劑盒說明書測定TG、TC、HDL-C,并按式(2)計(jì)算低密度脂蛋白膽固醇含量[10],按式(3)計(jì)算動脈粥樣硬化指數(shù)AI。

式(2)

式(3)

式中:CLDL-C為低密度脂蛋白膽固醇含量(mmol/L),CTC為總膽固醇含量(mmol/L),CTG為甘油三酯含量(mmol/L),CHDL-C為高密度脂蛋白膽固醇含量(mmol/L)。

1.2.5 小鼠肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)的測定 將小鼠處死后,取肝臟和皮下、附睪和腎周圍白色脂肪組織,電子天平稱量其濕重,并計(jì)算肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)。

式(4)

式(5)

式中:m為小鼠體重(g),m1為小鼠肝臟重(g),m2為小鼠皮下、附睪和腎周圍白色脂肪組織總重(g)。

1.2.6 脂肪組織病理學(xué)觀察 取同一部位的脂肪組織經(jīng)10%甲醛溶液固定,將固定好的組織進(jìn)行流水沖洗、梯度酒精脫水、石蠟包埋、6 μm厚度的常規(guī)切片,采用HE染色法染色。隨后在光學(xué)顯微鏡下對每個(gè)樣本40×物鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察和圖像分析,運(yùn)用AxioVision Real 4.6 軟件分析測量脂肪細(xì)胞面積,取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠狀態(tài)觀察

飼養(yǎng)過程中,觀察和記錄各組小鼠狀態(tài)發(fā)現(xiàn)各組小鼠精神狀態(tài)良好,毛色正常,毛發(fā)光滑柔順,攝食飲水排便無異常,生長發(fā)育良好,說明喂食45%的高脂飼料及灌胃翅果油不會對小鼠狀態(tài)及生長狀況產(chǎn)生不利影響。

2.2 翅果油干預(yù)對高脂飲食小鼠攝食量及攝入熱量的影響

由圖1可知,各組小鼠攝食量具有顯著性差異(P<0.05)。與ND組相比,HFD組小鼠攝食量顯著降低(P<0.05),這可能是因?yàn)殚L期食用高油脂、高熱量的飲食,容易使小鼠產(chǎn)生飽腹感,抑制小鼠食欲,從而降低了攝食量[12]。與HFD組相比,翅果油干預(yù)后攝食量顯著降低(P<0.05),說明翅果油對小鼠的攝食量具有一定的干預(yù)作用。與ND組相比,HFD組小鼠攝入熱量較高,翅果油各劑量干預(yù)后有所下降,但各組小鼠的攝入熱量不具有顯著性差異(P>0.05)。

圖1 翅果油對高脂飲食小鼠攝食量和攝入熱量的影響 Fig.1 Effect of EMO on food and caloric intake of high-diet mice注:與ND組比較,*表示有顯著性差異(P<0.05)， **表示極顯著性差異(P<0.01);與HFD組比較,#表示有顯著性差異(P<0.05), ##表示有極顯著性差異(P<0.01);圖2a、圖2c同。

2.3 翅果油干預(yù)對高脂飲食小鼠體重的影響

體重增加是形成肥胖的最直觀體現(xiàn),因此體重是判斷肥胖的一個(gè)重要指標(biāo)[11],各組小鼠體重變化如表1所示,由結(jié)果可以看出,小鼠喂養(yǎng)前3周,與ND組相比,HFD組小鼠體重增長無顯著性差異(P>0.05);喂養(yǎng)4周后,高脂飲食組小鼠體重顯著高于正常組小鼠(P<0.05);喂養(yǎng)5周后,與ND組相比,HFD組小鼠體重具有極顯著差異(P<0.01),喂養(yǎng)8周后,HFD組小鼠體重超過正常組小鼠體重的27.56%,表明高脂飲食可以誘導(dǎo)肥胖形成。

由表1可知,與HFD組相比,干預(yù)5周時(shí),ME組和HE組小鼠體重顯著低于HFD組(P<0.05);干預(yù)6周時(shí),LE組小鼠體重顯著低于HFD組(P<0.05),ME和HE組小鼠體重極顯著低于HFD組(P<0.01),且隨著干預(yù)時(shí)間的延長,翅果油對高脂飲食小鼠體重的降低作用越來越明顯;干預(yù)8周時(shí)LE、ME和HE組小鼠體重與HFD組小鼠比較,分別極顯著降低了8.33%、14.78%和10.09%(P<0.01),說明翅果油對高脂飲食引起的肥胖具有明顯的抑制作用,且ME組干預(yù)效果最好,HE和LE組次之。

2.4 翅果油干預(yù)對高脂飲食小鼠Lee’s指數(shù)的影響

Lee’s指數(shù)綜合反映了體重與體長的比例關(guān)系,是評價(jià)肥胖程度的有效指數(shù)[13-14]。由表2可知,與ND組相比,HFD組小鼠Lee’s指數(shù)極顯著升高了6.16%(P<0.01);與HFD組相比,LE、ME和HE組小鼠Lee’s指數(shù)分別降低了1.10%、3.68%和2.39%,其中ME組Lee’s指數(shù)與ND組無顯著性差異(P>0.05)。

表1 翅果油對高脂飲食小鼠體重的影響Table 1 Effect of EMO on weight of high-diet

注:與ND組比較,*表示有顯著性差異(P<0.05),**表示有極顯著差異(P<0.01);與HFD組比較,#表示有顯著性差異(P<0.05),##表示有極顯著差異(P<0.01);表2～表4同。

表2 翅果油對高脂飲食小鼠Lee’s指數(shù)的影響Table 2 Effect of EMO on Lee’s index of

2.5 翅果油干預(yù)對高脂飲食小鼠肝臟、肝臟系數(shù)及肝脂的影響

內(nèi)臟脂肪重量的增加是診斷肥胖發(fā)生的一個(gè)重要依據(jù)[15],且肝臟是參與體內(nèi)脂質(zhì)合成和代謝的主要靶器官[16],因此肝臟脂質(zhì)沉積也是形成肥胖的主要原因之一。由表3可知,與ND組相比,HFD組小鼠肝重極顯著升高(P<0.01);與HFD組相比,LE、ME和HE組肝重,分別顯著降低了9.63%、13.33%和12.59%(P<0.05)。此外,與ND組相比,HFD組小鼠肝臟TC和TG含量均極顯著升高(P<0.01);與HFD組相比,翅果油各劑量組肝臟TC含量有所降低,但效果不顯著(P>0.05),LE、ME組肝臟TG含量極顯著降低(P<0.01),HE組降低肝臟TG含量不顯著(P>0.05);綜上可知,翅果油干預(yù)可以緩解高脂飲食造成的肝臟脂質(zhì)沉積,且中劑量組作用效果較好。

表3 翅果油對高脂飲食小鼠肝重、肝臟系數(shù)、肝臟TC和TG的影響Table 3 Effect of EMO on liver,liver index,hepatic TC and TG of high-diet

表4 翅果油對高脂飲食小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C及AI的影響Table 4 Effect of EMO on serum TC,TG,HDL-C,LDL-C,and AI of high-diet

2.6 翅果油干預(yù)對高脂飲食小鼠血脂含量及AI的影響

肥胖會導(dǎo)致脂代謝發(fā)生紊亂,主要表現(xiàn)為血液中TC、TG及LDL-C含量升高,HDL-C含量降低,并且血脂含量異常增加了動脈粥樣硬化、心血管疾病及高血壓等代謝疾病發(fā)生的概率[17-18]。由表4可知,與ND組相比,高脂飲食組血清中TC、TG及LDL-C含量均極顯著升高(P<0.01),說明高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血脂代謝紊亂;與高脂飲食組相比,翅果油低、中、高劑量組血清中TC、TG及LDL-C含量均顯著降低(P<0.05)。其中TC含量分別降低了47.03%、47.82%和35.57%;TG含量分別降低了28.28%、30.34%和22.07%;LDL-C含量分別降低了63.91%、69.23%和53.58%。與HFD組相比,翅果油低、中、高劑量組HDL-C含量有所上升,AI值有所下降,但改善效果不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明翅果油可有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥。

2.7 翅果油干預(yù)對高脂飲食小鼠脂肪重、脂肪系數(shù)、脂肪組織病理切片及脂肪細(xì)胞面積的影響

如圖2a所示,與ND組相比,HFD組脂肪重及脂肪系數(shù)極顯著升高(P<0.01),且脂肪重超過低脂對照組222.61%;與HFD組相比,翅果油低、中、高劑量組小鼠白色脂肪重及脂肪系數(shù)均顯著降低(P<0.05),脂肪重分別降低了11.05%、22.37% 和10.24%,說明翅果油具有一定降低體內(nèi)脂肪含量的作用,且中劑量組降脂效果最佳。

圖2 翅果油對高脂飲食小鼠脂肪重及脂肪系數(shù)、脂肪細(xì)胞大小和脂肪細(xì)胞面積的影響Fig.2 Effect of EMO on fat,fat coefficient,adipocyte size and adipocyte area size of high-diet mice注:a:脂肪重及脂肪系數(shù);b:HE染色(400×);c:脂肪細(xì)胞面積。

如圖2b所示,正常組脂肪細(xì)胞排列整齊、分布均勻且大小一致;與ND組相比,HFD組脂肪細(xì)胞變大、大小不均,顯微鏡相同視野下脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯減少;與HFD組相比,翅果油劑量組脂肪細(xì)胞直徑有所減小,細(xì)胞排列整齊,顯微鏡相同視野下脂肪細(xì)胞有所增多。如圖2c所示,與ND相比,HFD組脂肪細(xì)胞面積極顯著增大(P<0.01),與高脂飲食組相比,翅果油劑量組脂肪細(xì)胞面積均有所減小,其中中劑量組效果較好。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在嚙齒動物和人類中,脂肪作為能量儲存在白色脂肪組織(White adipose tissue,WAT)中,健康WAT的主要特征是存在更小和更多的脂肪細(xì)胞[19]。當(dāng)機(jī)體肥胖時(shí),脂肪量增加,主要表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞肥大(細(xì)胞大小增加)或脂肪細(xì)胞增生(通過從最初的脂肪細(xì)胞分化從而增加脂肪細(xì)胞數(shù)量)[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)抑制由于脂肪細(xì)胞數(shù)量增加(增生)和細(xì)胞增大(肥大)引起的脂肪組織擴(kuò)張,可以作為預(yù)防和或治療肥胖癥的重要方法[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中,通過觀察脂肪組織病理學(xué)切片可以看出:高脂飲食導(dǎo)致脂肪組織細(xì)胞增大,翅果油干預(yù)后脂肪細(xì)胞有所減小;通過脂肪細(xì)胞面積圖更直觀地反映出翅果油干預(yù)可以減小脂肪細(xì)胞面積。說明翅果油可以通過抑制脂肪細(xì)胞增大而達(dá)到預(yù)防肥胖的目的。

表5 小鼠脂肪重、脂肪細(xì)胞面積、肝臟TC、TG和血脂水平之間的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of fat mass,adipocyte area size,liver TC,TG and blood lipid levels

注：*.在0.05水平上顯著相關(guān);**.在0.01水平上顯著相關(guān)。

2.8 相關(guān)性分析

如表5所示,脂肪重與脂肪細(xì)胞面積呈顯著正相關(guān)(P<0.05),說明高脂飲食能引起脂肪組織的堆積,這可能與脂肪細(xì)胞面積增大有關(guān);脂肪重、脂肪細(xì)胞面積與肝臟TC和TG呈顯著正相關(guān)(P<0.05),即脂肪重量增加時(shí),肝臟血脂水平升高。有文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)體內(nèi)脂肪量過度增加時(shí),會刺激脂肪組織中TG快速分解形成游離脂肪酸,游離脂肪酸經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肝臟,在肝臟中重新合成TG。這一過程使肝臟中TG合成速率大于TG分解速率,從而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累量增多[23],實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果,脂肪重與肝臟脂質(zhì)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與報(bào)道中結(jié)果相一致。肥胖最先誘發(fā)的是高血脂癥和非酒精性脂肪肝,而非酒精性脂肪肝的一個(gè)重要特征就是肝臟脂質(zhì)沉積[24],更為嚴(yán)重的是,當(dāng)機(jī)體內(nèi)脂肪組織過度積累達(dá)到其儲存容量時(shí),就會發(fā)生脂肪細(xì)胞死亡、炎癥和纖維化[25]。因此,內(nèi)臟脂肪細(xì)胞是否健康,是肥胖機(jī)體代謝是否正常的關(guān)鍵決定因素[26]。

此外,由表5還可以看出,脂肪重與血清HDL-C呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與AI值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),說明減少機(jī)體脂肪的含量還可以有效地預(yù)防高血脂癥及動脈粥樣硬化的發(fā)生。其原因可能是,高脂血癥是驅(qū)動動脈粥樣硬化發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素,且增加了中風(fēng)和其他心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[27],降低血清中TC、TG、LDL-C含量,升高HDL-C含量便可達(dá)到治療高脂血癥的目的,且HDL-C是拮抗動脈粥樣硬化的脂蛋白[28],HDL-C水平提高可有效預(yù)防動脈粥樣硬化。因此,翅果油干預(yù)可以通過抑制由高脂飲食誘發(fā)的肥胖降低機(jī)體高血脂癥及相關(guān)代謝疾病發(fā)生的概率。

3 結(jié)論

本研究以C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對象,通過對高脂飲食小鼠進(jìn)行翅果油干預(yù),證實(shí)低劑量和中劑量翅果油能夠顯著降低小鼠體質(zhì)量、血清TG、TC、LDL-C含量、肝臟TG含量(P<0.05)以及抑制脂肪細(xì)胞增大,且翅果油中劑量干預(yù)效果較好,說明攝入翅果油對于預(yù)防高血脂、肥胖及相關(guān)疾病具有一定的功效,但其降脂減肥機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究,從而為翅果油產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。