(江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院,湖北武漢 430056)

甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是目前最常見(jiàn)且最具代表性的合成毒品之一[1]。近年來(lái),METH的濫用趨勢(shì)日益嚴(yán)重。長(zhǎng)期濫用METH會(huì)使濫用者的前額葉皮層、海馬及紋狀體等腦區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元損傷和核團(tuán)萎縮,這與大腦功能變化,如情感認(rèn)知、記憶障礙等關(guān)系密切,可能是METH產(chǎn)生精神損害的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。METH濫用可引起動(dòng)物大腦灰質(zhì)減少、多巴胺能等神經(jīng)元末梢損傷[2]和細(xì)胞凋亡[3-4]。此外,METH濫用可致體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5]。目前,METH神經(jīng)毒性的機(jī)制尚未完全明確[6-7]。研究顯示氧化應(yīng)激是METH所致神經(jīng)損傷的重要作用機(jī)制之一。METH能使多巴胺(Dopamine,DA)水平升高,過(guò)量的DA可引起自由基如活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的不斷生成[8],攻擊生物大分子[9-10],進(jìn)而引發(fā)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終產(chǎn)生神經(jīng)毒性[11-12]。以往METH導(dǎo)致氧化應(yīng)激主要是研究ROS引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)過(guò)氧化損傷,但是對(duì)于METH造成的DNA損傷的相關(guān)研究甚少。

研究表明,N-乙酰半胱氨酸等抗氧化劑對(duì)自由基引起的DNA氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用[13-15]。西青果多酚(Terminalia chebula polyphenol extract,TCPE)是本實(shí)驗(yàn)室前期從西青果中提取純化的產(chǎn)物,經(jīng)過(guò)體外綜合評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)西青果多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力[16],而關(guān)于西青果多酚對(duì)METH神經(jīng)損傷的保護(hù)作用目前尚無(wú)報(bào)道。

本研究以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞為研究對(duì)象,建立體外PC12細(xì)胞METH損傷模型,并用不同濃度西青果多酚進(jìn)行干預(yù),探討西青果多酚對(duì)METH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制,以期為西青果多酚的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù);甲基苯丙胺 湖北省公安廳;西青果多酚 本實(shí)驗(yàn)室提取[16];RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline,PBS)、青/鏈霉素溶液 美國(guó)Gibco公司;MTT、DMSO、DCFH-DA熒光探針 美國(guó)Sigma公司;Muse Annexin V & Dead Cell試劑盒 德國(guó)Merck & Millipore公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所;GAPDH抗體(鼠抗)、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗 武漢博士德生物有限公司;γ-H2AX抗體(兔抗) 上海愛(ài)必信生物科技公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1300 Series A2超凈工作臺(tái)、3308 CO2培養(yǎng)箱、Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Multifuge X1R冷凍離心機(jī)、Fluoroskan Ascent FL熒光酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;UP-250超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;MuseTM流式細(xì)胞儀 德國(guó)Merck & Millipore公司;Olympus IX71倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司;Mini-Protean Tetra電泳槽、PowerPac Basic電源、Trans-Blot TurboTM轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;Gene Gnome 5化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 香港基因有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西青果多酚制備及溶液配制 西青果多酚粉末由本實(shí)驗(yàn)室前期提取,冷凍干燥[16],樣品中多酚含量為71.1%。將西青果多酚溶于無(wú)水乙醇制成100 mg/mL的西青果多酚儲(chǔ)存液,再依次溶于1640完全培養(yǎng)基配制成不同終濃度的西青果多酚溶液,其濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200及400 μg/mL(無(wú)水乙醇濃度在不同終濃度的西青果多酚溶液中占比小于0.5%)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素溶液)對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。PC12細(xì)胞為貼壁細(xì)胞,當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量,且呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí),用0.25%的胰蛋白酶消化后1000 r/min離心6 min,棄上清,加入1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將密度調(diào)整約為1×105個(gè)/mL,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別將細(xì)胞接種至96孔板(每孔100 μL)、6孔板(每孔2 mL)和培養(yǎng)瓶(每瓶5 mL)中。

1.2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè) 96孔板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后棄去原1640培養(yǎng)液,分別用不同濃度的西青果多酚(6.25、12.5、25、50、100、200及400 μg/mL)干預(yù)后檢測(cè)細(xì)胞存活率,然后根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出的合適濃度的西青果多酚(25、50、100、200、400 μg/mL)與3 mmol/L METH混合后共同給藥處理PC12細(xì)胞(100 μL/孔),每組6個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),隨后每孔加入10 μL無(wú)菌的MTT溶液(5 mg/mL),置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液,振蕩混勻,通過(guò)酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞存活率:

細(xì)胞存活率(%)=暴露組OD值/對(duì)照組OD值×100

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 6孔板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后棄去原1640培養(yǎng)液,加入不同濃度的西青果多酚(25、50、100和200 μg/mL)與3 mmol/L METH,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后離心,棄上清,用PBS洗兩次,按照Muse Annexin V & Dead Cell試劑盒說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞并染色30 min。隨后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 DNA損傷水平檢測(cè) 6孔板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的西青果多酚(25、50、100、200 μg/mL)與3 mmol/L METH,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化離心進(jìn)行彗星電泳實(shí)驗(yàn)[17]。細(xì)胞消化后用正常熔點(diǎn)和低熔點(diǎn)膠制成膠板。將膠板置于裂解液應(yīng)用液(2.5 mol/L NaCl,100 mmol/L Na2EDTA·2H2O,10 mmol/L Tris,使用前加入1% TritonX-100,pH10)中,4 ℃避光裂解1.5 h。漂洗兩次,電泳液(0.3 mmol/L NaOH和1 mmol/L Na2EDTA,pH>13)中4 ℃避光解旋20 min,25 V電壓下電泳15 min。漂洗兩次,中和液(0.4 mol/L Tris,pH7.5)中浸泡5 min,2.5 μg/mL溴化乙錠避光染色20 min。用熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)515～560 nm)觀察并拍照。結(jié)果使用CASP軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞γ-H2AX蛋白表達(dá)水平 6孔板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的西青果多酚(25、50、100、200 μg/mL)與3 mmol/L METH,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。按RIPA∶PMSF∶廣譜磷酸酶抑制劑∶cocktail=100∶1∶1∶2的比例(體積比)配好裂解液,每組細(xì)胞沉淀加入100 μL裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃、12000×g離心15 min,吸取上清用BCA法測(cè)量蛋白濃度。將蛋白樣品沸水浴5 min變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳,并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。隨后用5%脫脂奶粉振搖封閉1 h,分別加一抗后室溫孵育1 h,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜,加二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像觀察并拍照[5]。用Image J軟件處理圖片,分析條帶灰度值,進(jìn)行歸一化處理。

1.2.7 SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測(cè) 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后按上述實(shí)驗(yàn)中相同的給藥和分組方法處理細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用胰蛋白酶消化后離心,棄上清,PBS重懸,超聲破碎細(xì)胞,按照SOD、GSH-Px和MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求,嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值,按照說(shuō)明書(shū)計(jì)算各組的SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.2.8 ROS水平檢測(cè) 6孔板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后按上述實(shí)驗(yàn)中相同的給藥和分組方法處理細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄上清,PBS漂洗2次,隨后加入終濃度為100 μmol/L的DCFH-DA,置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中30 min,棄去上清,加入PBS漂洗3次。胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,加入1 mL PBS重懸細(xì)胞,通過(guò)熒光酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)538 nm測(cè)定各組熒光強(qiáng)度值[18],每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分析各組熒光強(qiáng)度,進(jìn)行歸一化處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 西青果多酚對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示,與對(duì)照組相比,25～400 μg/mL西青果多酚干預(yù)組PC12細(xì)胞存活率極顯著升高(P<0.01)。因此,用25～400 μg/mL西青果多酚進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 西青果多酚對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響(n=6)Fig.1 Effect of TCPE on the survival rates of PC12 cells(n=6)注:與對(duì)照組相比,**表示極顯著(P<0.01)。

2.2 西青果多酚對(duì)METH誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示,與對(duì)照組相比,3 mmol/L METH組PC12細(xì)胞存活率極顯著下降(P<0.01)。與METH組相比,25 μg/mL西青果多酚處理組PC12細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05),50、100、200、400 μg/mL西青果多酚處理組PC12細(xì)胞存活率極顯著升高(P<0.01)。

圖2 西青果多酚對(duì)METH染毒后PC12細(xì)胞存活率的影響(n=6)Fig.2 Effect of TCPE on the survival rates of PC12 cells after METH treatment(n=6)注:與對(duì)照組相比,*表示顯著(P<0.05),**表示極顯著(P<0.01);與3 mmol/L METH組相比,#表示顯著(P<0.05),##表示極顯著(P<0.01)。圖3B、圖4B、圖5B、圖6同。

2.3 西青果多酚對(duì)METH誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示,與對(duì)照組相比,3 mmol/L METH組PC12細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01);與3 mmol/L METH組相比,50、100、200 μg/mL西青果多酚均極顯著降低PC12細(xì)胞的凋亡率(P<0.01)。以上結(jié)果表明西青果多酚能明顯抑制METH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

圖3 西青果多酚對(duì)METH染毒后的PC12細(xì)胞凋亡的影響(n=3)Fig.3 Protective effect of TCPE on apoptosis of PC12 cells after METH treatment(n=3)注:A:流式細(xì)胞儀凋亡代表圖;B:PC12細(xì)胞凋亡結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。

2.4 西青果多酚對(duì)METH誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞DNA損傷的影響

如圖4所示,與對(duì)照組相比,3 mmol/L METH組細(xì)胞尾部DNA含量百分比極顯著升高(P<0.01);與3 mmol/L METH組相比,25、50、100、200 μg/mL西青果多酚組細(xì)胞尾部DNA含量百分比極顯著降低(P<0.01),表明西青果多酚能明顯抑制METH引起的PC12細(xì)胞DNA損傷。

圖4 西青果多酚對(duì)METH染毒后的PC12細(xì)胞DNA損傷水平Fig.4 Effect of TCPE on DNA damage level in PC12 cells after METH treatment

2.5 西青果多酚對(duì)METH染毒后PC12細(xì)胞γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示,與對(duì)照組相比,3 mmol/L METH組細(xì)胞γ-H2AX蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01),與3 mmol/L METH組相比,50、100、200 μg/mL西青果多酚組細(xì)胞γ-H2AX的蛋白表達(dá)極顯著降低(P<0.01),表明西青果多酚對(duì)METH造成的DNA損傷具有明顯的保護(hù)作用。

圖5 西青果多酚對(duì)METH染毒后的PC12細(xì)胞γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of TCPE on γ-H2AX expression in PC12 cells after METH treatment

圖6 西青果多酚對(duì)METH染毒PC12細(xì)胞SOD、GSH-Px活力、MDA和ROS水平的影響(n=3)Fig.6 Effect of TCPE on SOD,GSH-Px activities,MDA and ROS levels of PC12 cells after METH treatment(n=3)

2.6 西青果多酚對(duì)METH染毒后PC12細(xì)胞SOD、GSH-Px活性和MDA、ROS水平的影響

SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,能夠有效清除自由基[19-20]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,也是氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)之一[21]。如圖6所示,與對(duì)照組相比,METH組細(xì)胞SOD和GSH-Px活力顯著降低(P<0.05),MDA含量顯著升高(P<0.05),ROS相對(duì)含量極顯著升高(P<0.01),與METH組相比,25～200 μg/mL西青果多酚組細(xì)胞SOD活力極顯著升高(P<0.01),GSH-Px活力顯著升高(P<0.05),MDA和ROS含量極顯著降低(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

研究表明,METH濫用會(huì)使神經(jīng)元細(xì)胞ROS升高,引起氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22-24]。DNA損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān),有文獻(xiàn)報(bào)道METH能導(dǎo)致大鼠紋狀體和伏隔核DNA損傷[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),METH能明顯增加細(xì)胞凋亡、DNA損傷、胞內(nèi)MDA和ROS含量,降低細(xì)胞存活率、胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性,西青果多酚能明顯抑制METH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、DNA損傷、胞內(nèi)MDA和ROS含量增加,抑制METH誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率、胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性下降。因此推測(cè)西青果多酚可能通過(guò)緩解METH導(dǎo)致的氧化損傷,減輕DNA損傷,從而對(duì)PC12細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示西青果多酚能明顯提高PC12細(xì)胞的存活率,抑制METH造成的細(xì)胞凋亡,表明西青果多酚對(duì)METH引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。文獻(xiàn)報(bào)道多酚類(lèi)物質(zhì)能通過(guò)抗氧化作用減輕過(guò)氧化氫引起的神經(jīng)損傷[26-28],與本研究結(jié)果相似,因此西青果多酚的神經(jīng)損傷保護(hù)作用可能與西青果多酚的抗氧化作用有關(guān)。

文獻(xiàn)報(bào)道抗氧化劑能緩解自由基引起的DNA損傷[29-31],本研究中彗星試驗(yàn)結(jié)果顯示西青果多酚能明顯降低METH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞DNA損傷程度,Western Blot結(jié)果顯示西青果多酚能明顯降低METH誘導(dǎo)的DNA損傷標(biāo)志蛋白的表達(dá),表明西青果多酚對(duì)METH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞DNA損傷具有保護(hù)作用。前期研究表明葡萄籽提取物[32]、馬蹄紫菀提取物[33]等可通過(guò)清除自由基,減輕自由基引起的DNA損傷,前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)西青果多酚具有很好的體外清除自由基能力[16],因此推測(cè)西青果多酚對(duì)METH引起的DNA損傷的保護(hù)作用可能與其提高細(xì)胞自由基清除能力有關(guān)。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn)西青果多酚能顯明顯提高PC12細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性,降低PC12細(xì)胞中MDA和ROS含量,這與文獻(xiàn)報(bào)道中褪黑素能明顯降低METH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[34]的結(jié)果相似。結(jié)合上述結(jié)果推測(cè)西青果多酚可能提高機(jī)體抗氧化酶活性,減少自由基的產(chǎn)生,抑制METH誘導(dǎo)的DNA損傷,從而起到對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)西青果多酚對(duì)METH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,主要表現(xiàn)在提高細(xì)胞存活率、SOD和GSH-Px活性,降低細(xì)胞凋亡率、DNA損傷水平、MDA和ROS含量。其作用機(jī)制可能是通過(guò)緩解氧化應(yīng)激、降低PC12細(xì)胞DNA損傷實(shí)現(xiàn)。今后將進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究METH引起DNA損傷以及西青果多酚對(duì)METH神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制,為研究METH神經(jīng)毒性機(jī)制和西青果多酚的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。