(溫州科技職業(yè)學(xué)院,浙江溫州 325006)

臺灣泥鰍(Paramisgumusdabryanusssp.)是臺灣地區(qū)選育的泥鰍新品種,肉鮮味美,富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸、多種礦物元素及B族維生素[1]。中醫(yī)認為,泥鰍具有補中氣、祛濕邪之用[2],被稱為“水中人參”,具有較高的藥用價值?，F(xiàn)有研究表明,從泥鰍中提取的蛋白、多糖、氨基酸等,具有提高機體免疫力、抗炎、抗氧化等作用[3-6]。

湯在中國人的飲食中居于十分重要的地位,古代哲人對湯膳的評價“寧可食無饌,不可飯無湯”就說明了湯膳的重要性[7]。湯的烹飪方式有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送,較大程度地保留食材風(fēng)味的同時,可使食材中的營養(yǎng)物質(zhì)最大程度地溶出促進消化,具有補充能量、滋補養(yǎng)生等功效[8]。不同的熬煮時間對湯的營養(yǎng)價值會有不同的影響,倪東東等[9]發(fā)現(xiàn),采用傳統(tǒng)常壓熬煮大鯢湯,熬煮60 min時湯中脂肪含量適宜,且飽和脂肪酸/多不飽和脂肪酸值(SFA/PUFA)最佳,氨基酸含量最高;朱琳等[10]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)烏魚湯在熬制1.5 h后,營養(yǎng)物質(zhì)的含量明顯提高,熬制魚湯的時間應(yīng)控制在1.5～3 h。

泥鰍湯是一道歷史悠久的家常菜,其食療和藥用價值早已被報道[11],但大部分集中在臨床醫(yī)學(xué)研究上,而關(guān)于泥鰍湯的營養(yǎng)成分種類及其含量、泥鰍湯的抗氧化性研究鮮見報道。

本實驗以臺灣泥鰍為原料,通過分析泥鰍湯的可溶性蛋白、游離氨基酸、蛋白質(zhì)組分變化及ABTS+·、DPPH·清除率,探究了泥鰍湯熬煮過程中營養(yǎng)品質(zhì)的變化規(guī)律及抗氧化能力的變化,旨為科學(xué)合理地烹飪臺灣泥鰍湯提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活臺灣泥鰍 浙江平陽美飛淡水泥鰍養(yǎng)殖專業(yè)合作社;食鹽、姜等 永輝超市;乙腈 色譜純,北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;正己烷 HPLC級,北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;十七種氨基酸標準品 中國藥品生物制品檢定所;蛋白Marker 10～200 kDa,福州飛凈生物科技有限公司;牛血清白蛋白、乙醇、SDS、尿素、巰基乙醇等 均為國產(chǎn)分析純。

Agilent1100液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;Agilent ZORBAX Eclipse AAA 安捷倫科技(中國)有限公司;伯樂Mini-PROTEAN Tetra cell165-8001電泳槽 美國Bio-Rad公司;721G紫外可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;ALPHA2-4/LSC真空冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臺灣泥鰍湯加工工藝 臺灣泥鰍→宰殺→放血→去黏液、內(nèi)臟→清洗→分割、稱質(zhì)量→加水→大火煮開→小火慢燉→臺灣泥鰍湯

1.2.2 不同熬煮時間對臺灣泥鰍湯品質(zhì)的影響 分別以30、60、90、120、150 min為熬煮時間熬制泥鰍湯,取100 mL泥鰍湯樣品,于4 ℃、15000 r/min下離心10 min,取上清液進行蛋白組分(可溶性蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)電泳及游離氨基酸組成)分析和ABTS+·、DPPH·清除率的測定。

1.2.3 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 采用雙縮脲法測定泥鰍湯中可溶性蛋白質(zhì)含量[12]。準確移取上清液1 mL于試管中,加入4 mL雙縮脲試劑,充分振蕩均勻,置于室溫下反應(yīng)30 min。然后,將試樣置于比色皿中用分光光度計在540 nm波長處測定吸光度。

1.2.4 游離氨基酸含量的測定 取上清液(1.2.2)2 mL于離心管中,加入2 mL 0.02 mol/L鹽酸,10000 r/min離心10 min,取上清液定容至10 mL用0.45 μm濾膜過濾,移取5 μL濾液采用安捷倫公司自動在線衍生化方法,一級氨基酸與鄰苯二甲醛、二級氨基酸與芴甲氧羰酰氯衍生后,采用高效液相色譜測定樣品[13]。色譜條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA(4.6×150 mm,3.5 μm);紫外檢測波長為338 nm,熒光檢測信號為(激發(fā)波長266 nm,發(fā)射波長305 nm);流動相A為40 mmol/L磷酸二氫鈉(pH7.8);流動相B為乙腈/甲醇/水=45/45/10;流速為1 mL/min;洗脫程序:0～31 min,0% B;31～33 min,54% B;33～41 min,100% B;41～43 min,0% B;流速為1 mL/min。取17種標準氨基酸混合樣品,每種最終濃度為0.25 μmol/mL,在同樣條件下進樣,將得到的每種氨基酸的峰面積對濃度作圖繪制17種氨基酸標準曲線,采用峰面積外標法進行定量。

1.2.5 SDS-PAGE蛋白電泳 取一定量的上清液(1.2.2)于真空冷凍干燥(絕對壓力85 Pa,升華溫度20 ℃)下干燥32 h,干燥所得樣品用蒸餾水稀釋10倍,添加等體積處理液(2% SDS、8 mol/L尿素、2%巰基乙醇)勻漿后100 ℃加熱5 min,室溫下在10000 r/min下離心15 min,上清液為上樣樣品。采用5%濃縮膠和12%分離膠,上樣量為10 μL。在穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上進行電泳,調(diào)節(jié)電流,濃縮膠中為15 mA,分離膠為20 mA。當(dāng)溴酚藍指示劑到達凝膠底部時停止電泳[14]。

1.2.6 抗氧化能力的測定

1.2.6.1 DPPH·清除率測定 參照文獻[15]中的方法并略做改進。取1 mL上清液(1.2.2)加1 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH,室溫下靜置30 min后,在517 nm波長處測吸光度變化。

DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai為1 mL的DPPH+l mL樣品的吸光度;Aj為1 mL溶劑+1 mL樣品的吸光度;A0為1 mL DPPH+1 mL溶劑的吸光度。

1.2.6.2 ABTS+·清除率的測定 參照胥莉等[16]的方法并稍作修改。將7 mmol/L的ABTS溶液10 mL和7.35 mmol/L的K2S2O8溶液5 mL混合后,在室溫下避光放置12～16 h,形成ABTS儲備液,使用前用無水乙醇稀釋成ABTS工作液,使其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。吸取50 μL上清液(1.2.2)與ABTS工作液3 mL混合均勻,室溫反應(yīng)10 min后,于734 nm波長處測定其吸光度(A樣品),空白組以水代替樣品(A空白)。按下式計算ABTS+·清除率:

ABTS+·清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件進行初步分析,并用Origin 8.5軟件作圖,采用SPSS 22.0軟件進行相關(guān)處理和分析,其中,顯著性分析采用t-檢驗,P>0.05說明無顯著性差異,P<0.05說明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熬煮時間對泥鰍湯可溶性蛋白含量的影響

熬煮過程中部分可溶性蛋白質(zhì)會溶于湯汁,且湯汁中的可溶性蛋白與肉湯的感官品質(zhì)具有正相關(guān)關(guān)系[17]。圖1為不同熬煮時間對泥鰍湯的可溶性蛋白含量的影響。由圖1可知,在熬煮過程中,熬煮30～150 min,湯中可溶性蛋白質(zhì)含量顯著(P<0.05)上升,在30～90 min期間上升速率較為相近,在90 min后上升速率有所提高,到150 min時可溶性蛋白質(zhì)含量達到18.49 mg/mL。這與倪冬冬等[9]研究大鯢湯加工過程中蛋白質(zhì)溶出趨勢一致。

圖1 不同熬煮時間對泥鰍湯的可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of different boiling time on soluble protein content of loach soup注:不同小寫表示差異顯著(P<0.05);圖3同。

2.2 不同熬煮時間對泥鰍湯蛋白組分的影響

不同熬煮時間泥鰍湯蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖2所示。由圖2可知,隨著熬煮時間的延長,分子量>100 kDa蛋白條帶逐漸變淺,分子量為63～100 kDa的蛋白條帶逐漸增多和加深,說明大分子蛋白在熬煮過程中發(fā)生降解,隨著熬煮時間的延長,蛋白質(zhì)降解程度不斷加深。在湯的熬煮過程中,肌肉纖維束開始破裂,肌肉纖維中的蛋白質(zhì)在熱的作用下開始降解,水解成不同大小的短肽以及相應(yīng)的游離氨基酸[18]。

表1 臺灣泥鰍湯的游離氨基酸含量Tabla 1 Free amino acids contents of in loach soup

圖2 不同熬煮時間泥鰍湯的SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of loach soup with different boiling time

2.3 不同熬煮時間對泥鰍湯游離氨基酸含量的影響

湯中的游離氨基酸有助于形成肉湯的鮮美滋味,提高其營養(yǎng)價值[19]。由表1可得,泥鰍湯中共檢測到17種氨基酸,總游離氨基酸(TAA)含量隨熬煮時間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,在90 min時TAA達到最大值2957.20 μg/mL,隨后急劇下降。在90 min時泥鰍湯中半胱氨酸(22.5%)、甘氨酸(19.0%)、丙氨酸(11.6%)和谷氨酸(9.6%)含量較高,其次為組氨酸、賴氨酸、脯氨酸以及亮氨酸,絲氨酸含量最少。其中,谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸具有不同程度的甜味和鮮味,還有呈苦味的組氨酸等,這些豐富的氨基酸賦予了泥鰍湯醇厚而鮮美的滋味[13]。在90 min之后,泥鰍湯中TAA急劇下降,這可能是因為泥鰍湯在熬煮過程中,肌肉中蛋白質(zhì)受熱降解成大小不同的小肽或者相應(yīng)的游離氨基酸,通過物質(zhì)交換溶出到湯汁中,當(dāng)熬煮至一定時間,氨基酸會降解成肌苷酸和各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),這影響了氨基酸在泥鰍湯中的含量,同時肌肉中的纖維組織經(jīng)過長時間熬煮會形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)吸附湯中的游離氨基酸[20-22]。動物肌肉細胞中含有多糖,在熱的作用下可水解生成單糖、雙糖和低聚糖[16],與湯中的游離氨基酸產(chǎn)生美拉德反應(yīng),這可能也是造成游離氨基酸含量降低的原因之一。

從必需氨基酸總量(EAA)分析比較,在90 min時泥鰍湯中必需氨基酸含有纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸,較其他組種類齊全且含量最高,為664.3 μg/mL。從鮮味氨基酸含量(UAA)分析比較,隨著熬煮時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在90 min時含量最高,達到1296.7 μg/mL,遠高于其他組;其中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸是泥鰍湯中主要的鮮味氨基酸,略不同于倪冬冬等[9]測得大鯢湯中主要鮮味氨基酸(丙氨酸、精氨酸、谷氨酸)的種類。

綜上,在熬煮時間達到90 min時,泥鰍湯中游離氨基酸含量較高且必需氨基酸種類豐富,此時的鮮味氨基酸含量高,泥鰍湯醇厚鮮美。

2.4 不同熬煮時間對泥鰍湯抗氧化能力的影響

由圖3可知,隨著熬煮時間的增加,ABTS+·清除率逐漸上升,這可能是泥鰍在加熱過程中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生多肽和游離氨基酸,極性基團數(shù)量增多,導(dǎo)致親水性增強,使其更容易與水溶性的ABTS+·發(fā)生作用,同時泥鰍多肽具有清除ABTS+·的能力[23]。在30～120 min時,ABTS+·清除率顯著(P<0.05)上升,從18.01%升至43.61%,熬煮到120 min時,ABTS+·清除率為43.29%,隨后略有下降。由于加熱烹飪會影響肉類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),使粗肽中更多的疏水性基團位點暴露,導(dǎo)致疏水性提高,使其更容易與水溶性的ABTS+·發(fā)生作用[24]。因此，ABTS+·清除率升高。

圖3 不同熬煮時間對泥鰍湯ABTS+·和DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of different boiling time on ABTS+·and DPPH· scavenging rate of loach soup

泥鰍湯表現(xiàn)出較高的DPPH·清除能力,在熬煮時間30～90 min范圍內(nèi),清除率顯著(P<0.05)上升,從11.66%上升到84.10%,隨熬煮時間延長,泥鰍中的脂肪溶出,湯中脂肪含量增加,使其容易捕獲脂溶性的DPPH·,同時肌肉中多糖在熬煮過程中不斷的溶出,而泥鰍中的多糖又具有清除DPPH·的作用[25];在90～120 min時DPPH·清除率趨于平穩(wěn)(84.10%～87.25%),這可能是由于多糖降解的影響;在50 min時清除率上升至93.23%,DPPH·清除率升高是由于長時間的熬煮,某些游離氨基酸降解成一些殘基,比如親核側(cè)鏈的Cys殘基等,這些物質(zhì)可以阻斷自由基的鏈式反應(yīng)[24]。

3 結(jié)論

在泥鰍湯的熬煮過程中,熬煮時間對泥鰍湯的營養(yǎng)成分和抗氧化活性產(chǎn)生了很大的影響。隨熬煮時間的延長,湯中可溶性蛋白質(zhì)含量顯著上升,在150 min達到18.49 mg/mL;SDS-PAGE蛋白電泳顯示,隨著熬煮時間的延長,大分子蛋白質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生多肽和氨基酸,在90 min湯中游離氨基酸含量最高達到2957.20 μg/mL,鮮味氨基酸含量高達到1296.70 μg/mL,湯汁口感鮮美。在抗氧化性方面,隨著熬煮時間的增加,湯中ABTS+·清除率和DPPH·的清除率整體呈上升趨勢。綜上,在烹飪臺灣泥鰍湯時,熬煮90 min較為合理,此時臺灣泥鰍湯的營養(yǎng)品質(zhì)較好,且抗氧化能性強。