錢余,蔡茹,周恩譜,黃進(jìn)寶,貢東衛(wèi)

臨床上各種原因引起的膀胱出口梗阻或神經(jīng)源性膀胱等所致的尿潴留需留置導(dǎo)尿或膀胱造瘺處理，但長期導(dǎo)尿或膀胱造瘺，易繼發(fā)革蘭氏陰性細(xì)菌感染引起的膀胱急、慢性炎癥損傷，臨床處理非常棘手[1，2]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)廣泛存在于葡萄、松樹、虎杖及花生等天然植物中，化學(xué)成分為3，5，4-三羥基二苯乙烯，屬于含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，分子式C14H12O3，分子量228.25，為無色針狀結(jié)晶，具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護(hù)心血管以及保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種生理功效[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過向大鼠膀胱內(nèi)植入導(dǎo)管，以大腸桿菌液灌注誘導(dǎo)大鼠膀胱粘膜感染損傷模型，采用白藜蘆醇溶液灌胃給藥，觀察膀胱粘膜病理、氧化-抗氧化和細(xì)胞因子變化，探討白藜蘆醇對(duì)感染性大鼠膀胱粘膜損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

材料與方法

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性SD大鼠45只，個(gè)體質(zhì)量(170±10)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)部提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2009-0021，獨(dú)立籠盒系統(tǒng)分籠飼養(yǎng)，室溫20 ～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照和黑暗每12 h改變1次，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水、攝食，常規(guī)飼養(yǎng)觀察1 w 無異常，體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.098，P＞0.05)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)經(jīng)過動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn))。

1.2藥品和試劑膀胱灌注用DH5α大腸桿菌溶液(108-9CFU/100UL，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供)，白藜蘆醇購自杭州瑞樹生化有限公司(29700-22-9)。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 及TNF-α 試劑盒均購自上海酶遠(yuǎn)生物科技有限公司。TGF-β1抗體購自英國Abcam 公司。

1.3主要儀器CR21GII超高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)，Nanodrop2000 微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)，EGll60組織包埋機(jī)、Rm2123組織切片機(jī)、CA5030組織染色機(jī)(德國Leica 公司)，CHK 型光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)，BI-2000 圖形圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟)，Model-680酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)。

2方法

2.1動(dòng)物分組、造模及給藥隨機(jī)分3組(每組15只):空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)組。除空白對(duì)照組外，其它兩組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(10%水合氯醛按0.3 mL/100 g)0.3 ～

0.5 mL，麻醉后將大鼠固定，尿道口用70%乙醇和碘酊消毒，將直徑1.4 mm的圓頭軟質(zhì)金屬導(dǎo)絲沾上無菌甘油后經(jīng)尿道插入大鼠膀胱內(nèi)，導(dǎo)絲另一端套上長6～8 mm、直徑3 mm 聚乙烯材料的導(dǎo)管，再套上推管，順著導(dǎo)絲用推管把導(dǎo)管推入膀胱并留置，拔出導(dǎo)絲，排空膀胱內(nèi)尿液，針筒吸入0.5 ml大腸桿菌溶液由推管注入膀胱后拔出推管。同等條件飼養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)組給予白藜蘆醇40 mg/kg 每天灌胃1次，模型對(duì)照組以等量的生理鹽水每日灌胃1次。

2.2指標(biāo)檢測(cè)10 d后處死各組大鼠，取膀胱組織于10%甲醛溶液中固定，按常規(guī)制作石蠟切片，HE染色，鏡下觀察病理變化。同時(shí)制作膀胱組織勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測(cè)。比色法檢測(cè)SOD、CAT、GSH-Px 及MDA、NO活性含量，免疫組化(ELISA法)檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的含量，Western blot 法檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)。

2.3統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，統(tǒng)計(jì)分析用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SD大鼠膀胱組織病理形態(tài)的改變

鏡下觀察顯示，模型對(duì)照組可見粘膜彌漫性充血、水腫，粘膜下層點(diǎn)狀出血或瘀血，毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯。炎性細(xì)胞浸潤延伸至肌層，可見粘膜層與肌層的纖維組織母細(xì)胞、小圓形細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤。白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)組粘膜下炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，纖維組織母細(xì)胞、小圓形細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤明顯消退(圖1)。

2白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的大鼠膀胱粘膜損傷的氧化應(yīng)激影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠膀胱內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px 含量顯著降低(t=18.79、9.09、20.87，P均＜0.01)，NO、MDA含量顯著升高(t=5.16、5.68，P均＜0.01)；與模型對(duì)照組比較，白藜蘆醇組大鼠膀胱SOD、CAT、GSH-Px 含量顯著升高(t=13.62、6.3、18.38，P均＜0.01)，MDA、NO含量顯著降低(t=4.4、2.78，P均＜0.01)(表1)。

3白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的膀胱粘膜損傷大鼠膀胱組織中各細(xì)胞因子的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠膀胱內(nèi)IL-1β、IL-8、TNF-α含量均顯著升高(t=9.38、4.28、6.83，P均＜0.01)，而IL-6、IL-10含量變化不明顯(t=0.56和0.97，P均＞0.05)；與模型對(duì)照組比較，白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)組IL-1β、IL-8、TNF-α炎性細(xì)胞因子均顯著降低(t=7.22、3.02、4.80，P均＜0.01)，而抑炎細(xì)胞因子IL-6、IL-10明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.69、4.68，P均＜0.01)(表2)。

圖1三組膀胱組織病理切片對(duì)比(HE:×150)

表2白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)大鼠膀胱粘膜損傷膀胱組織中細(xì)胞因子含量比較(pg/mL)(X ±s，n=15)

4白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的大鼠膀胱粘膜損傷后大鼠膀胱組織中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物TGF-β1表達(dá)的影響

大鼠膀胱組織中TGF-β1表達(dá)量，空白對(duì)照組為1.00±0.23，模型對(duì)照組為2.07±0.45，模型對(duì)照組大鼠膀胱組織中TGF-β1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.20，P＜0.01)；白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)組TGF-β1蛋白表達(dá)量為1.24±0.31，比模型對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.88，P＜0.01)。

討 論

白藜蘆醇是植物在潮濕環(huán)境下遭到真菌侵害時(shí)自身分泌的一種抗逆物質(zhì)，在葡萄和漿果表皮中Res的含量較高。1963年Nonomura 等[6]提出Res是某些中草藥治療炎癥、脂類代謝和心臟疾病的有效成分之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Res在抗氧化和誘除自由基以及影響花生四烯酸代謝方面[7，8]生物學(xué)效應(yīng)明顯，劉婭等[9]通過體外研究揭示Res對(duì)酪氨酸蛋白激酶(PTK)有抑制作用，提示它有免疫調(diào)節(jié)方面的重要作用。前期，我們通過大鼠前列腺炎模型，證實(shí)Res通過抑制巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)活化，減少炎癥過程中IL-1、IL-6和TNF-α等產(chǎn)生，對(duì)前列腺炎模型大鼠有明顯的抗炎治療作用[10]。

本文模擬臨床留置導(dǎo)尿，向大鼠膀胱內(nèi)植入異物導(dǎo)管+大腸桿菌灌注誘導(dǎo)，人為制造大鼠膀胱粘膜感染損傷模型，使其膀胱內(nèi)壁氧化-抗氧化平衡態(tài)被破壞，隨后以白藜蘆醇進(jìn)行治療，觀察治療結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠感染大腸桿菌后，其膀胱SOD、CAT、GSH-Px 含量顯著降低，NO、MDA含量顯著升高，說明異物導(dǎo)管+大腸桿菌灌注有氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成膀胱組織損傷。白藜蘆醇組感染大鼠通過白藜蘆醇液灌胃治療后，與模型對(duì)照組比較其SOD、CAT、GSH-Px含量顯著升高，NO、MDA含量顯著降低，說明白藜蘆醇清除氧自由基，恢復(fù)體內(nèi)氧化-抗氧化動(dòng)態(tài)平衡。

模型對(duì)照組中IL-1β、IL-8、TNF-α含量均顯著高于空白對(duì)照組，表明在大鼠膀胱組織中，氧化應(yīng)激損傷會(huì)進(jìn)一步促使炎性細(xì)因子水平上升，在病理上表現(xiàn)粘膜彌漫性充血、水腫，粘膜下層有點(diǎn)狀出血或瘀血，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，炎細(xì)胞向肌層浸潤，可見粘膜固有層和肌層有纖維組織母細(xì)胞、小圓形細(xì)胞和漿細(xì)胞；白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)組IL-1β、IL-8、TNF-α炎性細(xì)胞因子均明顯降低，而抑炎細(xì)胞因子IL-6、IL-10 顯著升高，表明提高了膀胱組織內(nèi)IL-6、IL-10含量，抑制T 細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖以及巨噬細(xì)胞活性，減少IL-1β、IL-8、TNF-α等炎性細(xì)胞因子生成，減弱炎細(xì)胞的黏附、滲出和浸潤，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮了抗炎作用[10]，在病理表現(xiàn)上可見白藜蘆醇組組織炎癥情況明顯好轉(zhuǎn)。

在感染、炎癥及氧化應(yīng)激損傷等病理?xiàng)l件下，機(jī)體會(huì)激活多種細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路，其中TGF-β1通路是重要的一員。TGF-β1本身也是一個(gè)強(qiáng)力的促纖維化因子，具調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖功能，可使上皮細(xì)胞間失去極性并連接分離，同時(shí)間質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的大量產(chǎn)生，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而促進(jìn)器官纖維化而喪失功能[11]。TGF-β1表達(dá)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組表達(dá)顯著升高，與模型對(duì)照組比較，白藜蘆醇組顯著降低，進(jìn)一步說明了白藜蘆醇對(duì)膀胱損傷后抗纖維化作用機(jī)制。

綜上所述，本研究揭示白藜蘆醇能顯著抑制大腸桿菌誘導(dǎo)的大鼠膀胱組織中MDA、NO水平，提高SOD、GSHPx、CAT 活性抗氧化應(yīng)激；降低促炎細(xì)胞因子1L-1β、IL-8、TNF-α的含量，提高抑炎細(xì)胞因子IL-6、IL-10 含量而抗炎；通過降低TGF-β1表達(dá)降低纖維化，從而起到保護(hù)膀胱粘膜作用，避免對(duì)膀胱組織傷害。故白藜蘆醇有望作為潛在藥物通過口服或膀胱灌注形式，治療臨床上各種原因引起需長期留置導(dǎo)尿或膀胱造瘺處理的尿潴留患者。