,*,*

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院,廣東廣州 510006;2.廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院,廣東中山 528458)

食藥用菌因為具有營養(yǎng)保健的雙重功效,逐漸受到越來越多人的重視,同時也成為大健康產(chǎn)業(yè)不可或缺的一部分[1]。食藥用菌營養(yǎng)成分極其豐富,包括多糖、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、脂肪酸、核苷酸、維生素、微量元素等[2-4],其中也包括8種人體必需氨基酸等[5]。此外,食藥用菌中萜類、甾體類、皂苷、黃酮、酚酸等抗炎活性成分不斷被發(fā)現(xiàn)[6-8]。食藥用菌也具有多種生物醫(yī)學(xué)功能,比如免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防心血管疾病、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生理功能[9-11]。

松茸是口蘑科真菌松口蘑的子實體,是一種名貴的野生食、藥用真菌[12]。猴頭菇,因其形狀似猴子而得名,又稱猴頭蘑。其肉質(zhì)細嫩,營養(yǎng)豐富,是文明中外的食藥兼用真菌[13]。杏鮑菇,屬傘菌目,側(cè)耳科,側(cè)耳屬[14],其菌肉肥厚,質(zhì)地鮮嫩,口感脆滑、爽口,是近年來開發(fā)栽培成功的集藥用、食用、食療一體的珍稀食用菌[15]。目前,就食藥用菌功效成分的研究主要集中在多糖、氨基酸等初級代謝產(chǎn)物方面[16-17],而對其具有多種藥理活性的多酚等次級代謝產(chǎn)物研究需要進一步探究[18]。

多酚是常見的營養(yǎng)物質(zhì)抗氧化劑,主要從水果、蔬菜、茶葉、咖啡、菇類及中草藥中提取[19-20]。多酚類物質(zhì)可通過直接清除自由基、抑制氧化酶系、絡(luò)合金屬離子等機理達到抗氧化作用[21-23]。多酚類物質(zhì)在食藥用菌中的含量也因品種的不同而不盡相同,且不同提取方法對其提取率影響較大。另一方面,目前Folin-酚測多酚的方法以及DPPH自由基清除的方法并沒有一個標準的規(guī)程。

本文選取松茸、猴頭菇、杏鮑菇三種食藥用菌,采取浸提和熱回流兩種提取方式分別提取其子實體的多酚,通過改進的Folin-酚測試方法測定提取物多酚含量,采用DPPH和ABTS法測試其清除自由基的能力,并以MTT法對UVB所致的HaCaT細胞光損傷的防護作用進行評價,以期為食藥用菌在功能食品方面的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松茸、杏鮑菇、猴頭菇子實體各1000 g 廣州清平市場;人永生化表皮細胞(HaCaT細胞) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院;胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰酶、青霉素、鏈霉素、磷酸緩沖溶液(PBS,pH=7.4) 美國Gibco公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、二甲基亞砜(DMSO)、焦性沒食子酸 阿拉丁試劑有限公司;噻唑藍(MTT) 美國Bio Basic Inc公司;福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑 上海荔達生物科技有限公司;碳酸鈉、過硫酸鉀、乙醇均為分析純 廣州化學(xué)試劑廠。

Lambda25型紫外可見分光光度計 珀金埃爾默儀器有限公司;SpectraMax Paradigm型多功能酶標儀 美谷分子儀器有限公司;CO2培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技有限公司;CL-1000M UVB型紫外交聯(lián)儀 美國UVP儀器有限公司;TC-15套式恒溫器 海寧市新華醫(yī)療器械廠;GT OIC-T20超聲儀 廣東固特超聲股份有限公司;TD5A-WS臺式低速離心機 湘儀集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚提取及供試品的制備 猴頭菇、杏鮑菇、松茸子實體經(jīng)50 ℃干燥箱中干燥至恒重,粉碎并過24目篩,分別稱取其粉末2份,各3.0 g,精密稱定于250 mL圓底燒瓶中,加入70%乙醇50 mL,記錄總重。分別浸泡提取24 h和采用回流溫度90 ℃、時間1.5 h進行提取,提取后將剩余部分補加溶劑至原重,用定性中速濾紙過濾,即得多酚浸提樣品液和熱回流提取樣品液。猴頭菇樣品液直接作為供試品待測,猴頭菇、松茸樣品液各稀釋2倍作為供試品待測。

1.2.2 猴頭菇浸提取樣品液多酚測定條件的考察 以猴頭菇浸提取樣品液為例進行方法學(xué)考察,其余5種樣品多酚測定均適合此檢測方法。參考Flion-酚測多酚的方法[24],分別對顯色溫度、顯色時間、碳酸鈉及Flion-酚用量按以下方法進行了優(yōu)化。

1.2.2.1 檢測波長的確定 于2支20 mL容量瓶中分別加入濃度0.1 mg/mL焦性沒食子酸標準品和猴頭菇浸提取供試品1.0 mL,10% Na2CO3溶液2.4 mL,Folin-酚試劑1.0 mL,快速搖勻,加去離子水定容,40 ℃水浴靜置反應(yīng)30 min。在500～900 nm波長范圍內(nèi)掃描,以確定最大吸收波長。

1.2.2.2 溫度和時間的確定 于4支20 mL容量瓶中分別加入猴頭菇浸提取供試品1.0 mL,10% Na2CO3溶液2.4 mL,Folin-酚試劑1 mL,快速搖勻,加去離子水定容。分別靜置于25、40、50、60 ℃水浴鍋中反應(yīng),前期每隔15 min測定一次,第30 min后每30 min測定一次,用紫外可見分光光度計測試A760,測試至180 min,以確定最佳顯色溫度和時間。

1.2.2.3 碳酸鈉和Flion-酚體積用量比例的確定 于8支20 mL容量瓶中各加入猴頭菇浸提取供試品1.0 mL,Folin-酚試劑各1.0 mL,以0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1的比例加入10% Na2CO3溶液,快速搖勻,加去離子水定容,置40 ℃水浴加熱反應(yīng)30 min,測定A760,以確定二者體積用量最佳比例。

1.2.2.4 Flion-酚用量的確定 于8支20 mL容量瓶中各加入猴頭菇浸提取供試品1.0 mL,分別加入10% Na2CO3溶液1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、4.0、4.8 mL,按2∶1比例分別加入Folin-酚試劑0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.4 mL,快速搖勻,加去離子水定容,置40 ℃水浴加熱反應(yīng)30 min,測定A760,以確定Flion-酚用量。

1.2.3 猴頭菇浸提取樣品液多酚測定的方法學(xué)考察 以猴頭菇浸提取樣品液為例,進行多酚測定的方法學(xué)考察。

沒食子酸標準溶液的配制:準確稱取焦性沒食子酸 6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mg,溶解在去離子水中,分別轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶中,用去離子水定容,搖勻,得質(zhì)量濃度為0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16 mg/mL的標準品溶液,靜置待測。

1.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取濃度0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16 mg/mL焦性沒食子酸標準品溶液各1.0 mL,按照前面確定的最適量及最適比例加入各試劑,即10% Na2CO3溶液3.0 mL,Folin-酚試劑1.5 mL,加去離子水定容到20 mL容量瓶中,迅速搖勻,置40 ℃水浴鍋中顯色30 min,測A760,以考察線性關(guān)系。

1.2.3.2 精密度實驗 取濃度0.1 mg/mL焦性沒食子酸標準品溶液1.0 mL,依次加入10% Na2CO3溶液3.0 mL,Folin-酚試劑1.5 mL,加去離子水定容到20 mL容量瓶中,迅速搖勻,置40 ℃水浴鍋中顯色反應(yīng)30 min,760 nm波長下連續(xù)測定6次OD值,以考察儀器精密度。

1.2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取待測供試品1.0 mL,按“精密度實驗”項下方法操作,顯色完成后待測液置于室溫,分別于0、30、60、90、120、150 min測定A760,以考察顯示液穩(wěn)定性。

1.2.3.4 重復(fù)性實驗 取同一待測樣品6份,按照“1.2.1”項下方法制備供試品。分別取1.0 mL,依法顯色測定A760,以考察方法重復(fù)性。

1.2.3.5 回收率實驗 取已知總酚含量的猴頭菇粉末9份,每份約1.5 g,精密稱定,分別按1∶0.8、1∶1、1∶1.2加入一定量的焦性沒食子酸標準品。按照“1.2.1”項下浸提取方法制備供試品。分別取供試品1.0 mL,按照前面確定的最適量及最適比例加入各試劑,顯色測定A760,以考察方法的準確度。

1.2.3.6 三種食藥用菌多酚含量的測定 精確量取三種食藥用菌子實體的多酚浸提和熱回流提取供試品各1.0 mL,每個供試品各取3份,10% Na2CO3溶液3.0 mL,Folin-酚試劑1.5 mL,快速搖勻,加去離子水定容到20 mL容量瓶中,40 ℃避光反應(yīng)30 min,反應(yīng)完全后,利用紫外-可見分光光度計,在760 nm下測定體系吸光值,根據(jù)沒食子酸標準品所得標準曲線得到供試品中多酚質(zhì)量濃度,按照式(1)計算子實體總多酚的含量。

子實體多酚含量(mg/g)=(50×C×N)/3

式(1)

式中,C為供試品多酚質(zhì)量濃度(mg/mL),N為樣品稀釋倍數(shù)(猴頭菇N=1;杏鮑菇,松茸N=2)。

1.2.4 抗氧化性測定 首先取三種食藥用菌子實體的浸提樣品液和熱回流提取樣品液各2 mL,然后加適量去離子水,冷凍干燥,計差重計算各樣品液的提取物濃度。

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 用70%乙醇分別對上述兩種提取方法中得到的樣品液作3倍、6倍、12倍、24倍、48倍、96倍稀釋,各取100 μL加100 μL 0.15 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液作為實驗組,100 μL 70%乙醇加100 μL 0.15 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液作為對照組,混合反應(yīng)60 min(3倍稀釋樣品反應(yīng)平衡,并驗證DPPH耗盡),使用酶標儀在517 nm波長處測定其吸光度。

按公式(2)計算各樣品的 DPPH自由基清除率。

式(2)

式中，A樣品為各濃度樣品60 min時的吸光度值;A平衡為最大濃度樣品60 min時的吸光度值(此時,反應(yīng)平衡,驗證DPPH耗盡);A對照為對照組60 min時的吸光度值。

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力的測定 ABTS自由基參考文獻[25]方法配制并有改進。用70%乙醇分別對上述兩種提取方法中得到的樣品液作4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍稀釋,各取100 μL加100 μL ABTS自由基溶液作為實驗組,100 μL 70%乙醇加100 μL ABTS自由基溶液作為對照組,混合反應(yīng)6 min(4倍稀釋樣品反應(yīng)平衡,并驗證ABTS耗盡),使用酶標儀在734 nm波長處測定其吸光度。按照公式(3)計算各樣品的ABTS自由基清除率。

式(3)

式中,A樣品為各濃度樣品6 min時的吸光度值;A平衡為最大濃度樣品6 min時的吸光度值(此時,反應(yīng)平衡,驗證ABTS耗盡);A對照為對照組6 min時的吸光度值。

1.2.5 熱回流提取樣品液對細胞光損傷防護能力的評價 為進一步驗證采用熱回流方式提取多酚的抗氧化效果,分別取猴頭菇、杏鮑菇、松茸熱回流提取樣品液,經(jīng)濃縮冷凍干燥,獲得提取物凍干粉,用生物級DMSO配制成50 mg/mL 的母液,備用。HaCaT細胞用含10% FBS及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的HaCaT細胞,用0.25%的胰酶消化,完全培養(yǎng)基終止吹打后以1000 r/min離心5 min,制備單細胞懸浮液并計數(shù),以8000/孔96孔板,每孔100 μL,于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h待細胞貼壁后,分為空白對照組、UVB損傷組、猴頭菇熱回流樣高劑量100 μg/mL+UVB組、猴頭菇熱回流樣低劑量10 μg/mL+UVB組、杏鮑菇熱回流樣高劑量100 μg/mL+UVB組、杏鮑菇熱回流樣低劑量10 μg/mL+UVB組、松茸熱回流樣高劑量100 μg/mL+UVB組、松茸熱回流樣低劑量10 μg/mL+UVB組,每組6個復(fù)孔,輕輕吸去上清液,以100 μL/孔藥物干預(yù),空白對照組和UVB損傷組不做任何處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,棄掉培養(yǎng)基,用PBS(pH=7.4)清洗2次,除空白組外,其它各組加30 μL PBS(pH=7.4),UVB損傷組、藥物防護組用紫外交聯(lián)儀給予50 mJ/cm2光劑量損傷細胞,空白組用錫箔紙覆蓋不給予UVB損傷,更換100 μL/孔10% FBS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組均加含0.5 mg/mL MTT的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 μL/孔,于培養(yǎng)箱中作用4 h后,小心棄掉上清液,各孔均加150 μL DMSO,于搖床避光低速搖晃5 min,用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。按公式(4)計算各組的細胞存活率。

式(4)

式中,A空白為空白對照組的吸光度值;A實驗為UVB損傷組或提取物防護組的吸光度值;A調(diào)零為未種細胞,且全程同法處理孔的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2016 軟件進行常規(guī)數(shù)據(jù)處理,并用GraphPad Prism 5.0 軟件作圖、求IC50值及t檢驗分析,P<0.05為差異顯著。實驗平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚測定條件的考察

通過“1.2.2”節(jié)的方法,分別對顯色溫度、顯色時間、碳酸鈉及Flion-酚用量等條件進行了考察,結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 樣品(A)和沒食子酸標準液(B)波長掃描Fig.1 Spectral absorption curve of sample(A)and standard gallic acid solution(B)

圖2 溫度和時間對反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of temperature and time on absorbance

圖3 碳酸鈉與福林酚體積用量比對反應(yīng)的影響Fig.3 Effects of ratio of sodium carbonate to Folin volume on absorbance

圖4 福林酚用量對反應(yīng)的影響Fig.4 Effects of volumes of Folin on absorbance

從圖1是沒食子酸工作液與供試品溶液分別和Folin-酚試劑顯色的全波長掃描圖,發(fā)現(xiàn)兩者均在760 nm處有最大吸收,故選檢測波長為760 nm。

從圖2可以看出,40 ℃顯色,反應(yīng)30 min時,吸光度值達到最大,吸光度值為0.618。50～60 ℃顯色30 min時,吸光度值降低,當(dāng)顯色溫度溫度大于40 ℃,吸光值隨著溫度的增加而降低。反應(yīng)溫度在25～40 ℃范圍內(nèi)時,吸光度值隨著溫度的增加而升高,說明一定溫度的升高可以加快顯色進程,但是溫度過高造成顯色體系不穩(wěn)定。結(jié)合顯色的程度及反應(yīng)體系的整體穩(wěn)定性,確定顯色溫度為40 ℃,顯色時間為30 min。

從圖3可以看出,10% Na2CO3溶液與Folin-酚試劑比例增加到2∶1時,吸光度值最大,確定碳酸鈉與Flion-酚比例為2∶1。

從圖4可以看出,當(dāng)Folin-酚試劑用量達到1.4 mL后,吸光度值增加不明顯,1.6 mL趨于穩(wěn)定,所以選取中間值即Folin-酚試劑的用量為1.5 mL,選取10% Na2CO3溶液的用量為3.0 mL。

2.2 多酚測定方法學(xué)考察結(jié)果

通過“1.2.3”的方法,分別對多酚測定方法的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等進行了考察。線性關(guān)系考察實驗,以標品質(zhì)量濃度為橫坐標,OD值為縱坐標繪制標準曲線,求得線性回歸方程為Y=5.2971X-0.1324,R2=0.9992,表明焦性沒食子酸在0.06～0.16 mg/mL范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。精密度實驗顯示,連續(xù)6次測試的OD值分別為0.403、0.401、0.405、0.402、0.404、0.403,RSD值為0.35%,表明儀器精密度良好;穩(wěn)定性實驗顯示,0～150 min測試的OD值分別為0.618、0.617、0.618、0.617、0.615、0.607,RSD值為0.69%,表明待測顯色液在150 min內(nèi)穩(wěn)定;重復(fù)性實驗顯示,6份同法提取樣品的OD值分別為0.615、0.639、0.618、0.631、0.627、0.625,RSD值為1.39%,表明本方法重復(fù)性良好;回收率實驗結(jié)果(表1)顯示,平均回收率為99.36%,RSD值為2.84%,表明改進的Folin-酚測試方法準確可靠,可用于樣品多酚含量的測定。

表1 回收率實驗結(jié)果(n=9)Table 1 Recovery results(n=9)

2.3 多酚含量比較

通過優(yōu)化的Flion-酚法分別對猴頭菇、杏鮑菇、松茸三種食藥用菌子實體提取樣品液進行了多酚測定,結(jié)果見表2。

表2 三種食藥用菌多酚含量比較Table 2 Comparison of total phenolic contents of three edible and medicinal

結(jié)果顯示在同種提取條件下,松茸多酚含量比杏鮑菇多酚與猴頭菇多酚含量高;而兩種提取方式相比,熱回流提取方式下的松茸多酚含量較高,表明其提取效果較好。

圖5 浸提提取方式的三種食藥用菌提取物清除DPPH自由基清除率曲線Fig.5 DPPH free radical scavenging rate of three edible and medicinal fungi by soaking extraction

2.4 清除DPPH自由基的IC50值

計算出來的各樣品液提取物濃度,如表3所示。不同濃度樣品溶液的DPPH自由基清除率實驗結(jié)果見圖5、圖6。提取物清除DPPH自由基的IC50值結(jié)果如表4所示。

表3 三種食藥用菌提取物的質(zhì)量濃度Table 3 Mass concentration of three edible

表4 各提取物清除DPPH自由基的IC50值Table 4 IC50 values of DPPH free

結(jié)果顯示,回流法制備的提取物清除DPPH自由基的能力強于浸提法,三種食藥用菌中,以松茸回流提取物清除DPPH自由基的IC50值最小,為(0.534±0.03) mg/mL。

2.5 清除ABTS自由基的IC50值

不同濃度樣品溶液的ABTS自由基清除率實驗結(jié)果見圖7、圖8。提取物清除ABTS自由基的IC50值結(jié)果如表5所示。

表5 各提取物清除ABTS自由基的IC50值Table 5 IC50 values of ABTS free

圖6 熱回流提取方式的三種食藥用菌提取物清除DPPH自由基清除率曲線Fig.6 DPPH free radical scavenging rate of three edible and medicinal fungi by heated reflux extraction

圖7 浸提提取方式的三種食藥用菌提取物清除ABTS自由基清除率曲線Fig.7 ABTS+· scavenging rate of three edible and medicinal fungi by soaking extraction

圖8 熱回流提取方式的三種食藥用菌提取物清除ABTS自由基清除率曲線Fig.8 ABTS+· scavenging rate of three edible and medicinal fungi by heated reflux extraction

圖9 三種食藥用菌提取物對UVB所致的HaCaT細胞光損傷的防護作用Fig.9 Protective effects of three edible and medicinal fungi extracts on photodamage of HaCaT cells induced by UVB注:與正常組比較,*表示P<0.05;與模型組比較,#表示P<0.05。

結(jié)果顯示,回流法制備的提取物清除ABTS自由基的能力強于浸提法,三種食藥用菌中,以松茸回流提取物清除ABTS自由基的IC50值最小,為(0.271±0.01) mg/mL。

2.6 細胞光損傷防護作用結(jié)果

防護作用見圖9。采用熱回流提取方式得到的提取物進行UVB損傷藥物預(yù)保護實驗。結(jié)果表明,與空白組相比,UVB組細胞增殖率顯著降低(P<0.05);三種食藥用菌提取物劑量達100 μg/mL時,均可顯著(P<0.05)提高細胞存活率,猴頭菇、杏鮑菇、松茸提取物作用細胞存活率分別為(94.23%±3.79%)、(94.605%±4.91%)、(97.814%±3.05%),三種藥物作用下均可以提高細胞存活率,多酚成分涉及具體作用機制需研究者進一步進行研究。

3 結(jié)論

本文通過改進的Folin-酚法測定了三種食藥用菌子實體的多酚含量,結(jié)果表明,熱回流法提取多酚的效果優(yōu)于浸提法,三種食藥用菌中以松茸多酚含量最高。通過DPPH和ABTS法對比了不同提取方法和不同食藥用菌提取物體外清除自由基的能力,結(jié)果表明,采用熱回流法的提取物對DPPH和ABTS自由基的清除能力強于浸提法,三種食藥用菌相比,以熱回流法提取的松茸提取物清除自由基的能力最強。提取物多酚含量與體外清除DPPH和ABTS自由基的能力呈正相關(guān)。熱回流提取法得到的杏鮑菇、猴頭菇、松茸提取物能夠有效的預(yù)防UVB所致的HaCaT細胞光損傷,多酚成分涉及具體作用機制需進一步進行研究。本文為食藥用菌在抗氧化功能食品方面的開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。