王 睿,張 鮮,高 揚,陳雙林,閆淑珍

(南京師范大學生命科學學院,江蘇 南京 210023)

對特定區(qū)域進行生物多樣性調(diào)查研究,是開展生物多樣性保護、物種生存狀態(tài)評價和合理開發(fā)利用物種資源的重要基礎(chǔ)性工作[1]。真菌是生物多樣性的重要組成類群,是自然生態(tài)系統(tǒng)中的分解者。子囊菌門是真菌界最大的類群,約有90 000種[2]。大型子囊菌一般為肉眼可見,子囊果直徑>1 mm 的子囊菌[3],其作用包括分解物質(zhì)、產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物、生物防治和治理環(huán)境污染[4]等。國內(nèi)外一直非常重視大型真菌多樣性,開展的相關(guān)研究也較多[5-7],但在特定區(qū)域開展大型子囊菌多樣性研究則不多見,而且目前對大型子囊菌的研究多集中于系統(tǒng)分類學[8-10]。

對湖北省大型真菌的研究主要集中于神農(nóng)架林區(qū)[11]、后河自然保護區(qū)[12]和宜昌市[13]等地[14-16],其中只有中國科學院神農(nóng)架真菌地衣考察隊[11]和陳啟武[16]重點關(guān)注了區(qū)域內(nèi)大型子囊菌,分別報道30和43種大型子囊菌。目前湖北省已報道大型子囊菌為93種,而興山縣僅報道4種[15-16]。興山縣地處三峽庫區(qū)范圍,地形復(fù)雜,氣候垂直差異大,且受長江峽谷暖流制約,小氣候十分明顯,屬于北亞熱帶常綠闊葉與落葉闊葉混交林山地,為大型子囊菌生長提供了適宜條件。大型子囊菌的組成和發(fā)生受季節(jié)、植被和地點等因素影響,為準確認識和掌握大型子囊菌資源多樣性,需要開展系統(tǒng)性調(diào)查研究。為全面掌握湖北省興山縣大型子囊菌物種資源多樣性,豐富對三峽庫區(qū)生物多樣性的認識,于大型子囊菌發(fā)生的主要季節(jié)對興山縣全域進行大型子囊菌資源調(diào)查、標本收集和物種研究。

1 材料與方法

1.1 標本采集和資源調(diào)查

分別于2016年10月、2017年4—10月以及2018年6和8月,在湖北省宜昌市興山縣進行大型子囊菌資源調(diào)查。興山縣位于31°04′～31°34′ N,110°25′～111°06′ E,地貌屬秦嶺大巴山體系,氣候?qū)賮啛釒Т箨懶约撅L氣候區(qū)。根據(jù)設(shè)置的調(diào)查網(wǎng)格,在分布于興山縣6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的20個采集點采集大型子囊菌標本,同時記錄標本編號、地理信息和生境信息等基本信息(圖1、表1)。

圖1 興山縣大型子囊菌調(diào)查地點分布

表1 興山縣大型子囊菌物種資源調(diào)查采樣地點信息

Table 1 Information list of the investigating points for macro-ascomycetes in Xingshan County

采集點所在鄉(xiāng)鎮(zhèn)海拔/m林分類型 象鼻嘴高橋鄉(xiāng)700～800針闊混交林 伍家坪高橋鄉(xiāng)1 100～1 200落葉闊葉林 孟家陵林場高陽鎮(zhèn)1 200～1 350針闊混交林 平水村古夫鎮(zhèn)350～450落葉闊葉林 鄭院古夫鎮(zhèn)700～800針闊混交林 竹園河村古夫鎮(zhèn)450～550落葉闊葉林 黃家灣黃糧鎮(zhèn)800～900針闊混交林 馬家山黃糧鎮(zhèn)1 400～1 500常綠闊葉林 龍門河南陽鎮(zhèn)1 400～1 600常綠落葉闊葉混交林 落步河南陽鎮(zhèn)900～920常綠闊葉林 廟埡南陽鎮(zhèn)850～950常綠落葉闊葉混交林 萬朝山南陽鎮(zhèn)1 150～1 250常綠落葉闊葉混交林 文武村南陽鎮(zhèn)200～300常綠闊葉林 后坪林場水月寺鎮(zhèn)1 500～1 600針葉林 野竹池水月寺鎮(zhèn)1 100～1 200常綠落葉闊葉混交林 板廟榛子鄉(xiāng)1 250～1 300常綠落葉闊葉混交林 橋溝榛子鄉(xiāng)1 380～1 450針闊混交林 青龍口榛子鄉(xiāng)1 500～1 550常綠落葉闊葉混交林 石板灣榛子鄉(xiāng)1 280～1 300常綠落葉闊葉混交林 石佛寺榛子鄉(xiāng)1 450～1 550常綠落葉闊葉混交林

每份標本分為兩個部分,一部分烘干干燥,作永久保留;另一部分采用硅膠干燥后,裝入密封袋中,用于分子系統(tǒng)學研究。憑證標本保存于南京師范大學微生物菌種保藏中心(microbial cultures center of Nanjing Normal University,MCCNNU)。

1.2 研究方法

大型子囊菌鑒定和分類學研究主要依靠比較形態(tài)學方法和分子生物學技術(shù)。形態(tài)學研究時綜合大型子囊菌標本的宏觀特征、顯微結(jié)構(gòu)和標本材料與化學試劑反應(yīng)特征,同時參照有關(guān)大型子囊菌分類文獻[17-19]。采用分子生物學方法鑒定時采用CTAB法[20]提取標本全基因組DNA,PCR擴增并測序nrDNA-ITS和nrDNA-LSU基因片段,引物分別為ITS1/ITS4[21]和LR0R/LR5[22]。PCR擴增體系為25 μL,引物各1 μL,DNA模板1 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。ITS-PCR反應(yīng)程序為94 ℃反應(yīng)4 min,94 ℃反應(yīng)30 s,50 ℃反應(yīng)30 s,72 ℃反應(yīng)2 min,循環(huán)35次,最后72 ℃反應(yīng)10 min。LSU-PCR反應(yīng)程序為:94 ℃反應(yīng)4 min,94 ℃ 反應(yīng)30 s,56 ℃反應(yīng)45 s,72 ℃反應(yīng)75 s,循環(huán)35次,最后72 ℃反應(yīng)10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)ρ為1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后,送交上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序后分別對所得ITS和LSU序列進行BLAST比對,采用MEGA 7軟件基于最大似然法、鄰接法和最大簡約法等方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹并結(jié)合形態(tài)特征進行物種鑒定。

通過基于LSU序列建立的大型子囊菌系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,所用序列來源為該研究獲得和NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載所得。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析流程為采用Mafft 7.149軟件進行序列比對,采用Gblocks 0.91b軟件選擇保守區(qū)域,采用Jmodeltest 2.1.7軟件選擇進化模型為GTR+G,采用RaxmlGUI 1.3.1軟件構(gòu)建最大似然樹,采用MrBayes 3.2.6軟件構(gòu)建貝葉斯樹,最后采用Figtree 1.4.3和Adobe Illustrator CS5 15.0.0軟件查看和編輯所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 興山縣大型子囊菌種類組成

從興山縣共采集大型子囊菌標本339份,鑒定為96種,隸屬于4綱5目20科48屬,其中,杯紫膠盤菌(Ascocorynecylichnium)、橘色小雙孢盤菌(Bisporellacitrina)和波托綠杯菌(Chlorociboriapoutoensis)等40種為在湖北省首次發(fā)現(xiàn)(表2)。

表2 湖北省興山縣大型子囊菌種類名錄

Table 2 The species list of Macro-ascomycetes in Xingshan County, Hubei Province

科種數(shù)代表物種發(fā)生季節(jié)春季夏季秋季營養(yǎng)類型分布地點數(shù) 綠杯盤菌科(Chlorociboriaceae)2波托綠杯菌(Chlorociboria poutoensis)1)-++木生1 地錘菌科(Cudoniaceae)1地匙菌(Spathularia flavida)-+-土生1 皮盤菌科(Dermateaceae)2烏黑布齒盤菌(Graddonia coracina)1)-+-木生1 柔膜菌科(Helotiaceae)6杯紫膠盤菌(Ascocoryne cylichnium)1)-++木生2 粒毛盤菌科(Lachnaceae)3異常粒毛盤菌(Lachnum abnorme)++-木生10 錘舌菌科(Leotiaceae)1潤滑錘舌菌(Leotia lubrica)-++土生5 蠟盤菌科(Rutstroemiaceae)1長柄蘭斯盤菌(Lanzia longipes)-+-木生2 核盤菌科(Sclerotiniaceae1橙紅雙頭孢盤菌(Dicephalospora rufocornea)-+-木生4 蟲草菌科(Cordycipitaceae)5蛹蟲草(Cordyceps militaris)+++蟲生4 肉座菌科(Hypocreaceae)3馬鞍菌寄生菌(Hypomyces cervinigenus)1)-+- 菌寄生1 線孢蟲草科(Ophiocordycipitaceae)5下垂線蟲草(Ophiocordyceps nutans)-+-蟲生5 圓盤菌科(Orbiliaceae)4腫絲圓盤菌(Orbilia inflatula)+--木生1 平盤菌科(Discinaceae)1黃褐鹿花菌(Gyromitra leucoxantha)+--木生1 馬鞍菌科(Helvellaceae)8馬鞍菌(Helvella elastica)-++土生3 羊肚菌科(Morchellaceae)1羊肚菌(Morchella esculenta)+--土生2 盤菌科(Pezizaceae)12米氏盤菌(Peziza michelii)1)-++土生7 火絲菌科(Pyronemataceae)17伊邁飾孢盤菌(Aleurina imaii)1)-+-土生3 肉杯菌科(Sarcoscyphaceae)9中華歪盤菌(Phillipsia chinensis)-++木生4 肉盤菌科(Sarcosomataceae)2暗盤菌(Plectania melastoma)1)++-木生6 炭角菌科(Xylariaceae)12山地炭團菌(Hypoxylon monticulosum)+--木生4

1)湖北省新記錄種。發(fā)生季節(jié)中春季為4—5月,夏季為6—8月,秋季為9—10月?！?”表示有發(fā)生,“-”表示沒有發(fā)生。

由表2可知，優(yōu)勢屬為盤菌屬(Peziza)(9種)、馬鞍菌屬(Helvella)(8種)和炭角菌屬(Xylaria)(7種),分別占總物種數(shù)的9.38%、8.33%和7.29%。優(yōu)勢科為火絲菌科(17種)、盤菌科(12種)和炭角菌科(12種),分別占總物種數(shù)的17.71%、12.50%和12.50%。優(yōu)勢目為盤菌目,包括50個物種,占總物種數(shù)的52.08%。興山縣分布較廣泛的大型子囊菌為異常粒毛盤菌(Lachnumabnorme)、米氏盤菌(Pezizamichelii)、甜盤菌(Pezizasuccosa)、半球土盤菌(Humariahemisphaerica)、蛾蛹蟲草(Cordycepspolyarthra)和暗盤菌(Plectaniamelastoma)等20種,占總物種數(shù)的20.81%;興山縣分布較不普遍的大型子囊菌為綠杯盤菌(Chlorociboriaaeruginosa)、地匙菌(Spathulariaflavida)和蟬棒束孢(Isariacicadae)等76種,僅在1～2個采集點發(fā)現(xiàn),占總物種數(shù)的79.17%。其中,88個物種分布在海拔800～1 600 m的區(qū)域,占總物種數(shù)的91.67%;77個物種分布在常綠落葉闊葉混交林中,占總物種數(shù)的80.21%。分布最廣泛大型子囊菌為異常粒毛盤菌,分布于10個采集點,海拔范圍為400～1 600 m,并存在于針葉林、落葉闊葉林、常綠闊葉林、常綠落葉闊葉混交林和針闊混交林等林分類型。

從生長季節(jié)來看,夏季發(fā)生的大型子囊菌明顯多于春秋兩季,有85種之多,占總物種數(shù)的85.42%。僅在春或秋季發(fā)生的大型子囊菌之和占總物種數(shù)的25.00%。而3個季節(jié)都有發(fā)生的大型子囊菌為蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)和蛾蛹蟲草,僅占總物種數(shù)的2.08%。有些物種表現(xiàn)出較強的季節(jié)性,如羊肚菌(Morchellaesculenta)發(fā)生于春季(4—5月),暗盤菌多發(fā)生于春夏之交(5—6月),大孢毛杯菌(Cookeinainsititia)、中華歪盤菌(Phillipsiachinensis)、西方肉杯菌(Sarcoscyphaoccidentalis)等物種多發(fā)生于夏秋季(8—10月)。

從營養(yǎng)類型來看,土生、木生、蟲生、菌寄生以及土生和木生兼生的大型子囊菌分別為41、40、10、2和3種,分別占總物種數(shù)的45.83%、44.79%和10.41%,其中半球土盤菌(Humariahemisphaerica)、鈍刺盾盤菌(Scutelliniatrechispora)和古巴炭角菌(Xylariacubensis)既可木生又可土生。除此之外,還發(fā)現(xiàn)2種真菌寄生菌。柔膜菌目大部分科屬都是木生,僅有地錘菌科地匙菌屬(Spathularia)和錘舌菌科錘舌菌屬(Leotia)為土生。肉座菌目除蟲生的棒束孢屬(Isaria)、蟲草屬(Cordyceps)和線蟲草屬(Ophiocordyceps)外,還發(fā)現(xiàn)肉座菌屬(Hypocrea)標本1種,基物為腐木;菌寄生菌屬(Hypomyces)標本2種,基物分別為盤菌和馬鞍菌。圓盤菌目全部為木生。盤菌目中,羊肚菌科、馬鞍菌科、盤菌科都生長在林中地上;唯一1份平盤菌科鹿花菌屬(Gyromitra)標本生長于腐木基質(zhì)上;火絲菌科大部分為土生,但個別物種為木生和土生兼生;肉杯菌科和肉盤菌科大部分為木生,也有如美洲叢耳菌(Wynneaamericana)個別物種為土生。

2.2 興山縣大型子囊菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

系統(tǒng)發(fā)育學分析共采用109條序列,其中包括該研究測得的興山縣大型子囊菌標本57個物種的83條序列,以及從NCBI下載的26條序列?；贚SU序列,構(gòu)建的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹和貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹具有相同的拓撲結(jié)構(gòu)。由圖2可知,興山縣大型子囊菌存在10個系統(tǒng)發(fā)育分支,每個分支均具有較高的支持度,基本支持形態(tài)學的分類觀點。分支Ⅰ由圓盤菌目圓盤菌科圓盤菌屬(Orbilia)的腫絲圓盤菌(Orbiliainflatula)獨立組成,在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上與分支Ⅱ互為平行分支。分支Ⅱ全部屬于盤菌目盤菌科,主要由盤菌屬的6個物種組成,而盤菌目盤菌科厚盤菌屬(Pachyella)的貼厚盤菌(Pachyellaadnata)也交織在此分支內(nèi)。按照經(jīng)典分類學處理方法,盤菌目平盤菌科鹿花菌屬和羊肚菌科羊肚菌屬(Morchella)在親緣關(guān)系上較為接近,它們在系統(tǒng)發(fā)育樹中共同組成分支Ⅲ,互為姐妹群。分支Ⅳ為較大分支,全部由馬鞍菌科馬鞍菌屬組成,包含1屬5種,再與分支Ⅲ互為姐妹群。分支Ⅴ由火絲菌科5屬9種組成,分支Ⅵ由盤菌目肉盤菌科暗盤菌屬(Plectania)的2個物種組成,分支Ⅴ和分支Ⅵ互為姐妹群。分支Ⅶ由盤菌目火絲菌科刺粉毛盤菌屬(Trichaleurina)的窄孢膠陀盤菌(Trichaleurinatenuispora)和盤菌目肉杯菌科5屬7種組成。分支Ⅷ由柔膜菌目組成,包括8科9屬11種,分支內(nèi)柔膜菌科囊盾盤菌屬(Ascocoryne)與地錘菌科地匙菌屬親緣關(guān)系更近。分支Ⅸ全部為肉座菌目,由蟲草菌科、肉座菌科和線蟲草菌科共6屬11種組成。分支Ⅹ全部為炭角菌目炭角菌科,共有1屬2種,該分支在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上與肉座菌目最為接近。

3 討論與結(jié)論

在湖北省興山縣發(fā)現(xiàn)子囊果>0.1 cm的非地衣型大型子囊菌物種4綱5目20科48屬96種,這說明興山縣非地衣型子囊菌資源極為豐富。其中,有40種為湖北省首次記載,伊邁飾孢盤菌(Aleurinaimaii)[19]、布氏蟲草(Cordycepsbrongniartii)[18]、印度毛杯菌(Cookeinaindica)[17]、神農(nóng)架被毛孢(Hirsutellashennongjiaensis)[23]、馬鞍菌寄生菌(Hypomycescervinigenus)[24]、盤菌寄生菌(Hypomycesstephanomatis)[25]、中華歪盤菌(Phillipsiachinensis)[17]和神農(nóng)架肉杯菌(Sarcoscyphashennongjiana)[17]等8種在全世界分布都較少,反映興山縣大型子囊菌具有特定的物種組成。目前,國內(nèi)已知肉杯菌科共有10屬33種1變種[17,26],而在興山縣就發(fā)現(xiàn)了5屬7種,說明該地肉杯菌科物種多樣性較高。

興山縣大型子囊菌物種多集中于海拔800～1 600 m,具有典型亞熱帶常綠落葉闊葉混交林的區(qū)域,最具代表性的區(qū)域為龍門河、萬朝山和榛子鄉(xiāng)等地。鄭院、平水河村和竹園河村等地海拔為200～800 m,林分類型以落葉闊葉林和針闊混交林為主,大型子囊菌資源較少,主要為柔膜菌目物種,且多生長于枯枝腐木上。后坪林場和孟家陵林場海拔為1 200～1 600 m,林分類型以針葉林為主,大型子囊菌資源也較少,這可能與這些地方植被成分較單一有關(guān)。

興山縣西北區(qū)域與神農(nóng)架國家級自然保護區(qū)相接,地貌和植被相近。神農(nóng)架已發(fā)現(xiàn)大型子囊菌16科26屬51種[11,16,23-25],筆者研究確認興山縣大型子囊菌20科48屬96種,兩地共有物種包括黃綠盤菌(Chlorospleniumchlora)、蛹蟲草、皺柄白馬鞍菌(Helvellacrispa)和腫絲圓盤菌(Orbiliainflatula)等16種。神農(nóng)架發(fā)現(xiàn)9種蟲草,興山縣也發(fā)現(xiàn)9種蟲草,兩地共有蟲草物種5種。神農(nóng)架發(fā)現(xiàn)9種馬鞍菌,興山縣發(fā)現(xiàn)8種馬鞍菌,兩地共有馬鞍菌物種5種。

加粗的GenBank登錄號為NCBI下載的序列,其他為該研究獲得的標本序列。

筆者研究未發(fā)現(xiàn)興山縣和神農(nóng)架都曾被報道的鹿花菌(Gyromitraesculenta)[15-16],但發(fā)現(xiàn)黃褐鹿花菌(Gyromitraleucoxantha)。筆者在興山縣發(fā)現(xiàn)肉座菌科的紅棕肉座菌(Hypocrearufa),神農(nóng)架也曾發(fā)現(xiàn)同屬物種黃肉座菌(Hypocreaargillacea)[16]。筆者在興山縣發(fā)現(xiàn)的大型子囊菌中有80種未曾在神農(nóng)架發(fā)現(xiàn),這說明興山縣具有獨特的大型子囊菌物種組成和豐富的物種資源。

筆者對興山縣大型子囊菌進行的分子系統(tǒng)學研究支持或佐證了子囊菌一些單元的分類處理觀點[9-10]。由圖2可知，來自興山縣龍門河國家森林公園的1份圓盤菌目圓盤菌科圓盤菌屬腫絲圓盤菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上獨立成為一個分支,且與盤菌科為平行分支,這支持了圓盤菌目為單目單科,具有獨立分類地位的觀點[27]。分支Ⅱ主要為盤菌屬物種,但厚盤菌屬也位于此分支內(nèi),這佐證了盤菌屬不是單系類群的觀點[28]。雖然鹿花菌屬與馬鞍菌屬和羊肚菌屬形態(tài)特征有些相似,但鹿花菌屬與羊肚菌屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系更近,而馬鞍菌科馬鞍菌屬5種卻獨立組成1個分支,這表明鹿花菌屬和羊肚菌屬與馬鞍菌屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并不與形態(tài)特征一致[29]。肉盤菌科在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方面與火絲菌科更近,而從營養(yǎng)菌絲隔膜的超微結(jié)構(gòu)來看,肉盤菌科與肉杯菌科的關(guān)系比其與盤菌目其他科的關(guān)系更近[17]。筆者研究中肉盤菌科首先獨立構(gòu)成1個小分支,再與火絲菌科等7屬組成1個大分支,然后與肉杯菌科組成的分支成為姐妹群,但由于樣本量較少,肉盤菌科與肉杯菌科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還需要進一步深入研究。柔膜菌目構(gòu)成的分支較復(fù)雜,其中柔膜菌科的囊盾盤菌屬、小雙孢盤菌屬和膜盤菌屬分屬于不同分支,這支持了柔膜菌科不是單系群的觀點[8]。在肉座菌目中,蟲草菌科與肉座菌科親緣關(guān)系更近,這也證實了前人的研究結(jié)論[30]。