唐文娟， 范紅艷， 張露文， 姜正二， 于海玲△

(1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 吉林 延吉 133000； 2吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 吉林 吉林 132013)

抑郁癥主要表現(xiàn)為情感、認(rèn)知和植物神經(jīng)功能紊亂癥狀，嚴(yán)重干擾了人們正常工作、睡眠、進(jìn)食和享受愉快生活的能力。由于其高患病率和高致殘率，抑郁癥已經(jīng)成為目前人類(lèi)面臨的最大的健康挑戰(zhàn)之一[1]。內(nèi)源性大麻素(endocannabinoids，eCB)系統(tǒng)是機(jī)體進(jìn)化過(guò)程中高度保守的內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，是一個(gè)調(diào)節(jié)情緒、認(rèn)知、植物神經(jīng)系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)過(guò)程的神經(jīng)調(diào)控體系。大量的神經(jīng)解剖學(xué)和精神藥理學(xué)研究表明，eCBs系統(tǒng)在神經(jīng)性疾病的易感性上起著重要作用，它能夠維持內(nèi)環(huán)境在應(yīng)激和焦慮下的穩(wěn)定狀態(tài)[2-4]。N-棕櫚酰乙醇胺 (N-palmitoylethanolamide，PEA) 在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)分布廣泛，主要是由膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，屬于內(nèi)源性脂肪酸乙醇胺家族成員之一，是經(jīng)典的eCBs 之一N-花生四烯酰乙醇胺(anandamide，AEA)的類(lèi)似物。PEA以較低水平(約幾百pmol/g)存在于每個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，但細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)可以刺激它的形成[5]，提示大腦中的PEA可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。PEA屬于過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα) 激動(dòng)劑家族[6]。大量數(shù)據(jù)表明，PPARα和PEA在CNS的表達(dá)在病理情況下發(fā)生很大的變化，PEA的一些特性已被證實(shí)是由PPARα轉(zhuǎn)錄活性所介導(dǎo)。由福爾馬林誘發(fā)的傷害性疼痛行為導(dǎo)致前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex，PFC)內(nèi)側(cè)PEA水平和PPARα的mRNA表達(dá)減少70%，PEA通過(guò)活化PPARα在神經(jīng)退行性癡呆的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭衅鸬缴窠?jīng)保護(hù)作用，PEA抗炎、止痛、抗應(yīng)激和抗驚厥特性的表征，也被認(rèn)為是通過(guò)PPARα作為其主要的細(xì)胞內(nèi)分子靶標(biāo)[6-9]。本課題組(2011和2017年)[10-11]、Crupi等[12]和Coppola等[13]的研究已經(jīng)相繼證實(shí)PEA在抑郁癥治療方面的潛力，但對(duì)PEA通過(guò)PPARα介導(dǎo)的情緒、情感調(diào)節(jié)及其抗抑郁具體機(jī)制的探討尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用大鼠CUMS模型并且應(yīng)用行為學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)手段研究PEA是否以PPARα為作用靶標(biāo)實(shí)施抗抑郁樣作用，初步揭示內(nèi)源性大麻素樣物質(zhì)PEA介導(dǎo)的PPARα途徑與抑郁癥的關(guān)系，為抑郁癥提供一條新的藥物治療途徑。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

PEA(延邊大學(xué)藥學(xué)院提供)；鹽酸氟西汀分散片(百憂(yōu)解，禮來(lái)蘇州制藥，規(guī)格為每片20 mg，批號(hào)8374A)；MK886(上海瀚香生物，批號(hào) 150313)；小鼠抗大鼠突觸小泡蛋白(synaptophysin,SYP)單克隆抗體和兔抗PPARα抗體(Sigma)；兔抗核纖層蛋白B(lamin B)單克隆抗體 (Abcam)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(G+H)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(康為世紀(jì)，批號(hào) CW0022)；PrimrScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa，批號(hào) RR014A)；細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定測(cè)試盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、DNA Ladder(BeyoRed)和PCR Kit with Tag購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。所用引物由Invitrogen公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠70只，體重(200±20) g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(吉)2017-0003。大鼠飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)自由攝食進(jìn)水7 d后，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，剔除得分較高或較低的動(dòng)物，將動(dòng)物隨機(jī)分為：(1)正常對(duì)照(control)組；(2)模型(vehicle)組(CUMS+0.5% CMC-Na 20 mL/kg， po)；(3)氟西汀(fluoxetine，F(xiàn)xt；5-羥色胺再攝取抑制劑，作為陽(yáng)性對(duì)照藥)組(CUMS+Fxt 10 mg/kg，po)；(4)PEA 2.5組(CUMS+PEA 2.5 mg/kg，po)；(5)PEA 5組(CUMS+PEA 5 mg/kg，po)；(6)PEA 10組(CUMS+PEA 10 mg/kg，po)；(7)PEA+MK886(CUMS+PEA 10 mg/kg，po+MK886 3 mg/kg，ip)組。每組10只。除正常對(duì)照組外，其余6組均接受共35 d的CUMS結(jié)合孤養(yǎng)應(yīng)激，藥物處理持續(xù)28 d。動(dòng)物分組及藥物處理見(jiàn)實(shí)驗(yàn)流程圖，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Experimental procedures. CUMS procedures were performed for 35 days, and drug treatment was performed for 28 days. Vehicle, Fxt (10 mg/kg), PEA (2.5, 5, or 10 mg/kg), or MK886 (3 mg/kg) was administered for 28 days starting at day 8 after initiating CUMS procedures.

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

3 主要方法

3.1CUMS模型的構(gòu)建 除正常對(duì)照組外，每組每日均施加不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激刺激, 包括夾尾1 min 、冰水游泳(5 ℃)5 min、閃光10 min、禁食禁水18 h、斜籠(45 ℃)22 h、熱水游泳(45 ℃)5 min、潮濕墊料(200 mL 水)17 h、空籠24 h、熱刺激(50 ℃)10 min、電擊(20 V，30 s)20 次、異物放置24 h等，以上刺激每天隨機(jī)安排2 種，相鄰2 d刺激種類(lèi)不相同，使動(dòng)物不能預(yù)知刺激的發(fā)生，刺激應(yīng)激持續(xù)35 d[14]。

3.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open-field test，OFT) 實(shí)驗(yàn)在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)空間、溫度、氣壓、環(huán)境濕度的情況下，采用OFT-100實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行，敞箱為長(zhǎng)×寬×高為525 mm×525 mm×415 mm 的黑色硬質(zhì)塑料裝置，底面劃分成 9 個(gè)面積相等的方格，攝像頭垂直距敞箱30 cm，四周用簾布圍好，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)采集和處理數(shù)據(jù)。保證每只大鼠被單獨(dú)放置在實(shí)驗(yàn)區(qū)的中心，由TM-Vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都TaiMeng軟件有限公司)檢測(cè)180 s內(nèi)大鼠的自發(fā)探究行為從而反應(yīng)其的活動(dòng)性及對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度，在兩只大鼠實(shí)驗(yàn)之間用75%乙醇擦拭設(shè)備，以消除氣味對(duì)下一只大鼠行為的影響。

3.3蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test，SPT) 實(shí)驗(yàn)前對(duì)每只大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)和訓(xùn)練：第1個(gè)24 h禁食禁水；第2個(gè)24 h每籠同時(shí)放置2瓶1%的蔗糖水溶液；第3個(gè)24 h位置隨機(jī)放置1%蔗糖水和飲用水各1瓶；第4個(gè)24 h禁食禁水；第5天進(jìn)行正式測(cè)試，每籠1瓶1%蔗糖水和1瓶飲用水隨機(jī)放置1 h。瓶子在測(cè)試前后分別稱(chēng)重，根據(jù)以下公式：蔗糖偏好率 (%)=蔗糖水消耗量/總液體消耗量×100%，計(jì)算每只大鼠的蔗糖偏好率[14]。

3.4腦切片的制備及免疫組化和組織病理學(xué)觀察 冰生理鹽水經(jīng)左心室灌注至右心房流出液變清后，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/L的PBS配制，pH 7.4)施行前固定。低溫下(0 ℃)迅速取出全腦，切除小腦及腦干后置于4%甲醛溶液中后固定12 h，石蠟包埋。

3.4.1免疫組化 石蠟切片60 ℃烤片40 min，脫蠟和水化，入二甲苯溶液2次，每次15 min，無(wú)水乙醇2次，每次10 min，95%和85%乙醇各5 min后，PBS溶液洗滌，抗原熱修復(fù)。組織表面滴加適量?jī)?nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫放置15 min，PBS溶液洗滌。切片滴加小鼠抗大鼠SYP單克隆抗體(1∶75)，4 ℃過(guò)夜。滴加適量的反應(yīng)增強(qiáng)劑，PBS溶液洗滌。滴加適量辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫30 min。DAB顯色，流水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗反藍(lán)。脫水，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)倒置顯微鏡(Olympus BX53)下觀察，拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均吸光度值。

3.4.2蘇木素-伊紅 (hematoxylin-eosin, HE)染色 組織切片干燥后入二甲苯溶液脫蠟，置于無(wú)水乙醇、95%、85%及75%的乙醇溶液梯度水化后，Harris蘇木素液染細(xì)胞核15 min，0.5%鹽酸乙醇稍分化10 s，流水沖洗30 min，置于伊紅溶液染色細(xì)胞質(zhì)2 min。入90%、95%乙醇和無(wú)水乙醇各2次，每次2 min；置于二甲苯溶液中透明，中性樹(shù)膠封片；光鏡下觀察，拍照。

3.5腦組織樣本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前12 h各組大鼠禁食不禁水，記錄體重后，10%水合氯醛麻醉大鼠(300 mg/kg，ip)冰生理鹽水經(jīng)左心室灌注至右心房流出液變清后，迅速斷頭取腦，全腦稱(chēng)重后，冰臺(tái)上分離皮質(zhì)前額葉，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

3.5.1Western blot法 核蛋白抽提試劑盒提取大鼠皮質(zhì)前額葉腦組織核蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取25 μg抽提蛋白上樣，電泳分離及轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃孵育兔抗PPARα抗體(1∶250)和兔抗lamin B單克隆抗體(1∶1 000)過(guò)夜，PBST洗膜，加入 II 抗2 h。置凝膠成像儀(Biospectrum)曝光，Lane 1D凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析。

3.5.2RT-PCR實(shí)驗(yàn) 大鼠PFC組織樣本50 mg加1 mL RNAiso Plus，5 min提取總RNA，紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行RNA定量。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)在PCR儀(Veriti)中進(jìn)行:95 ℃ 5 min 1個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物5 μL在2.5% agarose凝膠中電泳。凝膠成像系統(tǒng)(ChampGelTM5000)分析條帶相對(duì)積分吸光度，以目的基因條帶與內(nèi)參GAPDH條帶吸光度比值(PPARα/GAPDH)作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間多重比較采用Bonferroni法，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 PEA對(duì)CUMS模型大鼠體重的影響

在經(jīng)過(guò)7 d的慢性應(yīng)激后各組大鼠體重增長(zhǎng)幅度均略低于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比，在CUMS第21天模型組、PEA+MK886組和PEA 5組體重獲得均明顯減少(P<0.01或P<0.05)。在CUMS第28天與正常對(duì)照組相比，模型組和PEA+MK886組體重獲得均明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，正常對(duì)照組及PEA 2.5組大鼠體重獲得均明顯增加(P<0.01)。在CUMS第35天與正常對(duì)照組相比，模型組和PEA+MK886組體重獲得均明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，正常對(duì)照組、PEA 2.5/5.0/10組和氟西汀組大鼠體重獲得均明顯增加(P<0.01或P<0.05)；與PEA 10組相比，PEA+MK886組體重獲得明顯減少(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)顯示，在CUMS造模第21～35天模型組大鼠體重獲得明顯低于正常對(duì)照組，提示此期間模型組大鼠攝食的減少和消化系統(tǒng)功能的紊亂；在CUMS造模第7～28天期間，各組大鼠體重增長(zhǎng)有較大波動(dòng)，提示此期間模型尚未穩(wěn)定；在CUMS第21～35天期間， PEA 10組與正常對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而PEA+MK886組與正常對(duì)照組相比差異則存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，表明MK886翻轉(zhuǎn)了PEA(10 mg/kg)對(duì)大鼠體重獲得的影響，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The changes of body weight of the rats during CUMS procedure and after drug treatment. Mean±SEM.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group;△P<0.05vsPEA 10 group.

圖2 藥物處理對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激大鼠體重的影響

2 PEA對(duì)CUMS模型大鼠OFT行為的影響

與正常對(duì)照組相比，CUMS后第28和35天，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖3A,不動(dòng)時(shí)間顯著增多(P<0.01)，見(jiàn)圖3B，運(yùn)動(dòng)距離顯著減少(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖3C，表明第28～35天，慢性應(yīng)激抑郁模型基本成功；與模型組相比，CUMS第28天，正常對(duì)照組、氟西汀組和PEA 5組運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3A，正常對(duì)照組、氟西汀組和PEA 5/10組的不動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖3B，正常對(duì)照組、氟西汀組和PEA 5/10組的運(yùn)動(dòng)距離顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖3C；與模型組相比，CUMS第35天，正常對(duì)照組、氟西汀組和PEA 2.5/5/10組的運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖3A，不動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖3B，運(yùn)動(dòng)距離顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖3C；CUMS第35天，與PEA 10組相比，PEA+MK886組的不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)距離顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖3B、C。

3 PEA對(duì)CUMS模型大鼠蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)的影響

在CUMS應(yīng)激前(0 d)大鼠基礎(chǔ)蔗糖偏好率基本一致(P>0.05)，慢性應(yīng)激第7天各組大鼠蔗糖偏好率出現(xiàn)偏離，但無(wú)明顯規(guī)律性。第28和35天，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠蔗糖偏好率顯著降低(P<0.01)；在CUMS第28天，與模型組相比，正常對(duì)照組、氟西汀組和PEA 2.5/5/10組蔗糖偏好率明顯增加(P<0.05或P<0.01)；在CUMS第35天，與模型組相比，正常對(duì)照組、氟西汀組和PEA 2.5/5/10組蔗糖偏好率均明顯增加(P<0.05或P<0.01)；提示在第28天后，大鼠CUMS模型的蔗糖偏好率已經(jīng)趨于穩(wěn)定，陽(yáng)性對(duì)照藥及受試化合物PEA對(duì)此也顯示明顯的改善作用。PEA+MK886組大鼠蔗糖偏好率在第28天和第35天與模型組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，但與正常對(duì)照組相比均顯著降低(P<0.01)，第35天與PEA 10組相比明顯降低(P<0.05)，提示此期間MK886可以逆轉(zhuǎn)PEA對(duì)大鼠蔗糖偏好率的改善效應(yīng)，見(jiàn)圖4。

Figure 3.The effects of PEA on open-field test performance during CUMS procedure and after drug treatment. The locomotion time (A), the immobility time (B) and the locomotion distance (C) in the open-field test were showed. Mean±SEM.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group;△P<0.05,△△P<0.01vsPEA 10 group.

圖3 PEA對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)的影響

Figure 4.The changes of the sucrose preference test performance during CUMS procedure and after PEA treatment. Mean±SEM.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group;△P<0.05vsPEA 10 group.

圖4 PEA對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激大鼠蔗糖偏好的影響

4 PEA對(duì)大鼠PFC中SYP蛋白表達(dá)的影響

光鏡(×400)下觀察組織切片并采圖拍攝相應(yīng)的PFC腦區(qū),正常對(duì)照組PFC中SYP陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀或點(diǎn)狀免疫標(biāo)記，數(shù)量較多，排列密集，染色深，神經(jīng)元胞核染成藍(lán)色,見(jiàn)圖5A。CUMS模型組PFC中SYP陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物較正常對(duì)照組相比排列稀疏、密度明顯降低，染色較淡，見(jiàn)圖5B，SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物平均吸光度顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖5H，提示CUMS可能誘導(dǎo)大鼠PFC的突觸數(shù)目減少或結(jié)構(gòu)退化。與CUMS模型組相比，氟西汀組和PEA 2.5/5/10組SYP陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物數(shù)量均有不同程度增多，見(jiàn)圖5B～5F，SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物平均吸光度均有所增加(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)圖5H，提示氟西汀及PEA長(zhǎng)期處理可以改善PFC的突觸可塑性。PEA+MK886組大鼠與正常對(duì)照組和PEA 10組相比PFC中SYP陽(yáng)性免疫反應(yīng)的棕黃色顆粒狀表達(dá)產(chǎn)物密度減少、染色較淡，見(jiàn)圖5G，SYP免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物平均吸光度顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖5H，提示MK886可能逆轉(zhuǎn)PEA對(duì)PFC中SYP陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的影響。

5 PEA對(duì)CUMS大鼠PFC組織形態(tài)的影響

腦組織常規(guī)石蠟切片，HE染色后，神經(jīng)元胞漿呈紫紅色，胞核呈紫藍(lán)色。光鏡下(×100)觀察顯示，正常組大鼠PFC神經(jīng)元排列較規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，胞核形態(tài)正常；CUMS模型組大鼠神經(jīng)元間隙明顯變大，細(xì)胞排列疏松紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模，細(xì)胞核固縮，深染，有空泡化和噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象;PEA組與氟西汀組大鼠神經(jīng)元排列趨于規(guī)則，細(xì)胞密度明顯增大，細(xì)胞膜較完整，細(xì)胞形態(tài)趨于正常化；PEA+MK886組大鼠神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，接近模型組，部分細(xì)胞有空泡化和核固縮現(xiàn)象，見(jiàn)圖6。這提示PEA和氟西汀可改善CUMS誘導(dǎo)的大鼠PFC神經(jīng)元的損傷、缺失現(xiàn)象，MK886可逆轉(zhuǎn)PEA對(duì)神經(jīng)元形態(tài)的影響。

6 PEA對(duì)CUMS模型大鼠PFC質(zhì)量指數(shù)變化的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠PFC質(zhì)量及PFC質(zhì)量指數(shù)(PFC/全腦質(zhì)量百分比)均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，正常對(duì)照組、氟西汀組和PEA 10組大鼠PFC質(zhì)量明顯增高(P<0.05或P<0.01)，正常對(duì)照組、氟西汀組和PEA 5/10 mg/kg組大鼠PFC/全腦質(zhì)量百分比明顯增高(P<0.05，P<0.01)；PEA+MK886組大鼠PFC質(zhì)量與正常對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，而與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

7 PEA對(duì)大鼠PFC中PPARα蛋白和mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，CUMS應(yīng)激增加了大鼠PFC中PPARα 蛋白及mRNA的表達(dá)水平(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，PEA 5/10劑量組大鼠PFC中PPARα 蛋白(P<0.05或P<0.01)及mRNA(P<0.05)的表達(dá)水平下調(diào)；PEA+MK886組大鼠PFC中PPARα蛋白(P<0.01)和mRNA(P<0.05)的表達(dá)與正常對(duì)照組相比均顯著上調(diào)，而與模型組相比差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；與PEA 10組相比，PEA+MK886組大鼠PFC中PPARα蛋白(P<0.01)和mRNA(P<0.05)的表達(dá)水平均顯著上調(diào),見(jiàn)圖8。

討 論

1 PEA改善CUMS模型大鼠行為學(xué)癥狀

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為應(yīng)激是包括抑郁癥在內(nèi)的情感類(lèi)精神疾病的主要誘因。神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)功能紊亂也是抑郁癥的特征之一，經(jīng)常導(dǎo)致體重、食欲和睡眠的改變，這些癥狀可能與額葉皮質(zhì)的某些表達(dá)異常有關(guān)[16]。慢性、低強(qiáng)度的應(yīng)激源是促進(jìn)抑郁發(fā)生、發(fā)展的主要原因。根據(jù)抑郁發(fā)作和應(yīng)激性生活事件的臨床關(guān)聯(lián)，許多包括應(yīng)激成分的動(dòng)物模型用于評(píng)價(jià)抗抑郁藥物活性。應(yīng)激動(dòng)物模型通常被用在抑郁癥的病理生理機(jī)制研究和抗抑郁藥物篩選等方面[11, 16]。CUMS是誘導(dǎo)行為和生理異常的抑郁癥狀的重要因素，CUMS模型動(dòng)物表現(xiàn)出的蔗糖攝入量減少、體重增加緩慢、自主活動(dòng)性及探究行為減弱、身體一般狀況的退化等異常表現(xiàn)與人類(lèi)的抑郁癥狀極為相似，因此CUMS模型經(jīng)常被用來(lái)作為研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型[15-16]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠CUMS抑郁模型，通過(guò)體重的監(jiān)測(cè)反映動(dòng)物的食欲和消化功能；通過(guò)OFT來(lái)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中的自發(fā)活性、探究性行為和對(duì)新環(huán)境的警覺(jué)性等行為[15]；通過(guò)評(píng)價(jià)抑郁癥的核心癥狀確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)獎(jiǎng)賞的敏感性和反應(yīng)程度[16]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)28～35 d的慢性應(yīng)激，大鼠體重增長(zhǎng)明顯下降，OFT中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離明顯減少，不動(dòng)時(shí)間明顯增多，SPT中蔗糖偏好率明顯降低，提示慢性應(yīng)激誘導(dǎo)了大鼠一系列生理指標(biāo)和行為學(xué)的異常表現(xiàn)，與抑郁癥患者的消化系統(tǒng)功能減弱、急性活動(dòng)和好奇心降低、對(duì)新鮮事物的接受能力減弱、對(duì)獎(jiǎng)賞敏感性降低、快感缺乏等生理功能和行為障礙的癥狀極為相似。CUMS大鼠經(jīng)過(guò)PEA慢性處理后，體重增長(zhǎng)明顯增加，提示其食欲、消化系統(tǒng)功能和情緒的改善；運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加、不動(dòng)時(shí)間的減少，說(shuō)明其運(yùn)動(dòng)功能和自主活動(dòng)性的正常化及急性活動(dòng)和好奇心的改善；增加的蔗糖偏好率表明大鼠獎(jiǎng)賞敏感性的部分恢復(fù)。然而在采用選擇性PPARα拮抗劑MK886與PEA合用后，PEA對(duì)大鼠行為學(xué)和生理功能的改善作用被部分或完全取消，這提示機(jī)體的PPARα通路可能參與PEA改善CUMS誘導(dǎo)的大鼠的抑郁樣行為效應(yīng)。

Figure 5.The effect of PEA on the expression of SYP in prefrontal cortex of the rats after 35 days of CUMS and 28 days of drug treatment. A～G: the expression of SYN was detected by immunohistochemistry staining (×400); H: the average absorbance of SYP. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group;△△P<0.01vsPEA 10 group.

圖5 免疫組化法檢測(cè)PEA對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激大鼠前額葉皮質(zhì)SYP表達(dá)的影響

Figure 6.The effect of PEA on the histomorphological changes of the prefrontal cortex in the rats after 35 days of CUMS and 28 days of drug treatment (HE staining, ×100).

圖6 HE染色法檢測(cè)PEA對(duì)CUMS皮質(zhì)前額葉大鼠的組織形態(tài)學(xué)的影響

Figure 7.The effect of PEA on the prefrontal cortex (PFC) weight (A) and the percentage of PFC to brain weight (B) after 35 days of CUMS and 28 days of drug treatment. Mean±SEM.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group.

圖7 PEA對(duì)CUMS大鼠前額葉皮質(zhì)質(zhì)量及其與全腦質(zhì)量百分比的影響

2 PEA調(diào)控CUMS模型大鼠PFC的PPARα通路，改善其突觸可塑性

額葉皮質(zhì)錐體細(xì)胞層受損導(dǎo)致內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex, mPFC)對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁行為反應(yīng)抑制能力的喪失，從而使HPA軸過(guò)度激活及改變重要的生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量，導(dǎo)致參與情緒和行為活動(dòng)能力的改變[17]。神經(jīng)影像學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者額葉皮質(zhì)的體積和厚度均減小，其中對(duì)于頻繁發(fā)病的抑郁癥患者在抑郁癥狀出現(xiàn)之前已經(jīng)發(fā)生皮質(zhì)體積的縮小，證實(shí)重度抑郁癥的某些功能障礙與額葉皮質(zhì)的異常改變密切相關(guān)[14]。腦皮質(zhì)神經(jīng)元之間信息交流的完成需要突觸的參與，保持突觸數(shù)量的穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)與功能的完整性對(duì)腦基本功能的維持是必要條件。突觸可塑性包括突觸傳遞效能和突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)目的改變，二者生理變化的基礎(chǔ)都涉及神經(jīng)元和突觸部位的某些蛋白質(zhì)、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、信使分子及離子等物質(zhì)變化。越來(lái)越多的證據(jù)證明，慢性應(yīng)激與抑郁癥可導(dǎo)致大腦特定區(qū)域內(nèi)的突觸可塑性相關(guān)結(jié)構(gòu)改變[18]。經(jīng)典的抗抑郁藥物產(chǎn)生治療作用的同時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)突觸可塑性關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)作用[19]，對(duì)于突觸可塑性的干預(yù)已經(jīng)成為治療抑郁癥藥物研究的一個(gè)新的靶標(biāo)。SYP是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性調(diào)節(jié)密切相關(guān)的突觸前膜囊泡蛋白，其表達(dá)豐富，約占突觸囊泡蛋白的10%，參與突觸的形成和遞質(zhì)的運(yùn)輸，是反映突觸發(fā)育和突觸可塑性的重要分子標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)SYP的表達(dá)可以間接反映突觸的數(shù)量和密度[20]。本實(shí)驗(yàn)中CUMS模型組大鼠PFC中SYP陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物數(shù)量明顯減少，提示慢性應(yīng)激可能導(dǎo)致大鼠PFC的突觸數(shù)目減少或結(jié)構(gòu)退化，神經(jīng)突觸傳遞效能降低。PEA慢性處理后PFC的SYP表達(dá)明顯增加，提示突觸可塑性的增加及突觸對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化做出反應(yīng)能力的增強(qiáng)。組織形態(tài)學(xué)及PFC重量指數(shù)觀察顯示，CUMS模型組大鼠PFC神經(jīng)元數(shù)量減少和形態(tài)改變，PFC質(zhì)量減小。PEA慢性處理后大鼠PFC神經(jīng)細(xì)胞排列趨于規(guī)則，細(xì)胞數(shù)目增多、形態(tài)趨于正常化，PFC質(zhì)量增加，提示PEA改善了CUMS大鼠PFC中神經(jīng)元損傷及額葉皮質(zhì)的萎縮；MK886預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了PEA(10 mg/kg)對(duì)CUMS大鼠PFC中SYP表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PEA可能通過(guò)調(diào)控PFC的PPARα通路，改善其突觸可塑性及神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用以拮抗大鼠的抑郁樣行為。

Figure 8.The effects of PEA on the expression of the PPARα nuclear protein (A) and PPARα mRNA (B) in the prefrontal cortex of CUMS-induced rats after 35 days of CUMS and 28 days of drug treatment. Mean±SEM.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group;△P<0.05,△△P<0.01vsPEA 10 group.

圖8 Western blot和RT-PCR法檢測(cè)PEA對(duì)CUMS大鼠前額葉皮質(zhì)PPARα蛋白和mRNA表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)額葉皮質(zhì)PPARα通路在PEA拮抗CUMS模型大鼠抑郁樣行為中的參與，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot和RT-PCR方法分別檢測(cè)大鼠PFC中PPARα 蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示慢性應(yīng)激增加大鼠PFC中PPARα蛋白和mRNA的表達(dá)，PEA慢性處理使PPARα在PFC的蛋白和mRNA表達(dá)水平接近正?；?，而MK886預(yù)處理則部分翻轉(zhuǎn)了PEA對(duì)PPARα蛋白和mRNA表達(dá)的作用。這提示長(zhǎng)期應(yīng)用外源性PEA可能干擾額葉皮質(zhì)PPARα蛋白的表達(dá)。基于以上數(shù)據(jù)，我們推測(cè)，慢性應(yīng)激處理可以抑制內(nèi)源性PEA的合成或增加PEA的消耗，導(dǎo)致大腦PFC內(nèi)PEA含量的降低。作為內(nèi)源性PPARα配體的PEA的長(zhǎng)期低水平狀態(tài)，可能誘導(dǎo)PPARα表達(dá)的代償性上調(diào)。這也許可以解釋為什么本實(shí)驗(yàn)中在慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠PPARα mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)。值得注意的是，通過(guò)補(bǔ)充外源性的PEA，這種腦內(nèi)低水平的PEA可以恢復(fù)到正常含量，這也使PPARα可能逐漸恢復(fù)到正常的表達(dá)水平，正如我們?cè)诒狙芯恐兴^察到的PEA長(zhǎng)期處理后PPARα的mRNA和蛋白表達(dá)水平的下調(diào)。然而，MK886阻止配體PEA作用于其受體PPARα，所以PFC組織中PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平在MK886和PEA聯(lián)合處理組與CUMS模型處理組表現(xiàn)為相似的上調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了我們的假說(shuō)，即PFC中PPARα通路參與了PEA的抗抑郁作用。如果在進(jìn)一步的研究中直接檢測(cè)PFC中的PEA水平和PPARα表達(dá)之間的相關(guān)性，上述假說(shuō)將得到更好的驗(yàn)證。