張飛飛， 趙士霞， 郝清卿， 李 榕， 李英肖， 黨 懿， 齊曉勇

(河北省人民醫(yī)院， 河北 石家莊 050051)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是各種心臟疾病的晚期階段，其患病率呈不斷升高趨勢(shì)，且具有較高的死亡率，死亡原因通常為惡性室性心律失常。慢性心力衰竭合并惡性心律失常的機(jī)制與心室肌電重構(gòu)密切相關(guān)，包括心肌細(xì)胞膜離子通道改變及細(xì)胞間縫隙連接的重構(gòu)[1]。心臟收縮力調(diào)節(jié)(cardiac contractility modulation, CCM)是在心肌組織絕對(duì)不應(yīng)期內(nèi)給予的高強(qiáng)度電刺激，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝，影響心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及胚胎基因蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)心肌收縮力，改善心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而改善心臟功能[2]。心臟收縮力調(diào)節(jié)是一種新興的非藥物治療心衰技術(shù)，其對(duì)于心室肌電重構(gòu)的影響仍需進(jìn)一步研究。本項(xiàng)工作應(yīng)用升主動(dòng)脈縮窄法建立兔慢性心力衰竭模型，測(cè)定心室電生理指標(biāo)及Kv1.4，Kv4.3及縫隙連接蛋白43(connexin 43, Cx43)的表達(dá)水平，探討心臟收縮力調(diào)節(jié)對(duì)于該模型心室肌電生理重構(gòu)的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

選用6月齡新西蘭大白兔30只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重2.5～3.5 kg，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，均于河北省人民醫(yī)院臨研中心動(dòng)物房飼養(yǎng)。采用MICROPACE EPS320心臟電生理刺激儀給予心臟收縮力調(diào)節(jié)；小兒用臨時(shí)起搏電極購自美敦力；應(yīng)用FX-4010型12道自動(dòng)分析心電圖機(jī)記錄體表心電圖；應(yīng)用Philips IU22彩色超聲診斷儀(探頭為S4-2，MHz)測(cè)定心臟超聲各指標(biāo)；抗Kv1.4、Kv4.3、Cx43和內(nèi)參照β-actin抗體均購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司；生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 主要方法

2.1慢性心力衰竭動(dòng)物模型的建立 3%戊巴比妥鈉溶液以1 mL/kg經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉后，將兔仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，備皮，于胸骨左緣2、3、4肋間區(qū)，打開胸腔，暴露心臟，于升主動(dòng)脈根部遠(yuǎn)端1.0 cm處游離升主動(dòng)脈根部約4～5 mm，環(huán)扎升主動(dòng)脈使其為原周長(zhǎng)60%。術(shù)中將小兒用臨時(shí)起搏電極彎針端縫合于心外膜左室前壁，直針端通過皮下穿刺固定于頸部，關(guān)閉胸腔。術(shù)后常規(guī)給予青霉素1.6×106U肌肉注射3 d預(yù)防感染。術(shù)后12周動(dòng)物出現(xiàn)食欲下降、精神差、呼吸急促等心衰癥狀同時(shí)行心臟超聲示左室射血分?jǐn)?shù)≤40%視為模型制作成功。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(sham)組僅開胸和固定電極；心衰(heart failure,HF)組開胸、環(huán)扎升主動(dòng)脈、固定電極；HF+CCM組開胸、環(huán)扎升主動(dòng)脈、固定電極，并于術(shù)后12周模型制作成功后給予4周CCM刺激。

2.3CCM刺激 暴露動(dòng)物模型頸部電極直針端，通過體表心電圖R波觸發(fā)EPS320刺激儀發(fā)放CCM刺激，脈寬2 ms，電壓7 V，于R波感知后延遲30 ms發(fā)放，每天刺激6 h，連續(xù)刺激4周。

2.4電生理指標(biāo)測(cè)定 記錄兔十二導(dǎo)聯(lián)心電圖，以Q波的起始點(diǎn)至T波終點(diǎn)測(cè)定QT間期，連續(xù)測(cè)定3個(gè)心動(dòng)周期取平均值。測(cè)定不同導(dǎo)聯(lián)最長(zhǎng)QT間期(QTmax)及最短QT間期(QTmin)，依據(jù)Bazett公式計(jì)算心率校正后的QT間期(QTc)，即QTc=QT/(R-R)1/2；采用電生理刺激儀以S1S2 程序遞減刺激法，以起搏閾值2倍為輸出電壓，測(cè)定250 ms基礎(chǔ)周長(zhǎng)時(shí)的心室有效不應(yīng)期(ventricular effective refrective period, VERP)，用S1S2間期遞減掃描，S1S2呈8∶1，步長(zhǎng)10 ms，當(dāng)S2不能引起心室激動(dòng)時(shí), 將此S2值增加10 ms，再次進(jìn)行S1S2間期遞減掃描,步長(zhǎng)2 ms,以S2激動(dòng)心室的最長(zhǎng)S1S2間期為VERP，重復(fù)測(cè)量3次。

2.5心室肌組織Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA水平的測(cè)定 使用TRIzol(Invitrogen)試劑提取心室肌標(biāo)本的總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，取1 μg總NRA參照TIANScript RT KIT試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：70 ℃ 5 min，25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。PCR引物由博海生物工程開發(fā)有限公司合成，具體引物序列見表1。將獲得的cDNA按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書擴(kuò)增目的基因,PCR熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線。應(yīng)用熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)定量 (relative quantification, RQ)值,將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。

2.6心室肌組織Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白表達(dá)的測(cè)定 取100 mg心室肌組織標(biāo)本，剪碎、離心，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)非連續(xù)梯度SDS-PAGE分離蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上置于封閉液中，室溫溫育1 h，再加入Ⅰ抗，4 ℃搖床上過夜，應(yīng)用洗液漂洗，再加入Ⅱ抗，室溫?fù)u床上孵育1 h，然后用洗液漂洗。最后將顯色劑加入PVDF膜上，1 min后放入暗室曝光。定影后采用UVP分析儀器，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，系統(tǒng)自動(dòng)生成每一個(gè)條帶灰度值。

表1 RT-qPCR的引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物一般情況

30只新西蘭大白兔中，假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活，心衰組術(shù)中因分離環(huán)扎升主動(dòng)脈過程中損傷分支動(dòng)脈出現(xiàn)大出血死亡1只，心衰+CCM組中因開胸過程中損傷胸廓內(nèi)動(dòng)脈發(fā)生大出血死亡1只。心衰組及心衰+CCM組中各存活9只且均滿足心衰標(biāo)準(zhǔn)。

2 電生理指標(biāo)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)第12周末，與假手術(shù)組相比，心衰組和心衰+CCM組QTc顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)第16周末，與心衰組相比，心衰+CCM組經(jīng)4周CCM刺激后QTc縮短(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)第16周末，與假手術(shù)組相比，心衰組和心衰+CCM組VERP顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；與心衰組相比，CCM顯著縮短心衰模型免VERP(P<0.05)。見表2。

表2 CCM對(duì)慢性心力衰竭兔QTc及VERP的影響

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group.

3 心室肌組織Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，心衰組心肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA水平顯著下降(P<0.05);與心衰組相比，CCM上調(diào)心衰兔心肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA的水平(P<0.05),見圖1。

Figure 1.The mRNA levels of Kv1.4, Kv4.3 and Cx43 in ventricular myocardium. Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05 HF group.

圖1 各組心室肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43的mRNA水平

4 心室肌組織Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，心衰組心肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 的蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);與心衰組相比，CCM上調(diào)心衰兔心肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白的表達(dá)水平(P<0.05),見圖2。

討 論

慢性心力衰竭是心肌組織對(duì)多種致病因素失代償而出現(xiàn)的心臟結(jié)構(gòu)和(或)功能異常的臨床綜合征，易并發(fā)惡性室性心律失常，是導(dǎo)致死亡的主要原因。慢性心力衰竭時(shí)惡性室性心律失常發(fā)生的根本機(jī)制為心室肌電重構(gòu)，包括細(xì)胞膜離子通道和細(xì)胞間縫隙連接蛋白的改變，從而導(dǎo)致心室肌細(xì)胞復(fù)極延遲，動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)及心室肌細(xì)胞間電傳導(dǎo)延遲或不均一性，最終出現(xiàn)心室肌復(fù)極離散度增加[3]?；趬毫ω?fù)荷增加是慢性心力衰竭發(fā)生的重要原因，且新西蘭兔心室肌組織與人類心室肌組織具有相似的離子通道及縫隙連接蛋白表達(dá)，本研究應(yīng)用升主動(dòng)脈縮窄法建立慢性心力衰竭兔模型，模擬人類慢性心力衰竭時(shí)心室肌電生理重構(gòu)[4]。QTc反映全部心室肌細(xì)胞除極和復(fù)極過程的總時(shí)程，與心肌細(xì)胞電活動(dòng)及室內(nèi)傳導(dǎo)等相關(guān)，QTc增大提示心室肌細(xì)胞異常激動(dòng)、室內(nèi)傳導(dǎo)延遲，可用于評(píng)價(jià)心肌電活動(dòng)狀態(tài)及惡性心律失常發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[5-7]。本研究通過升主動(dòng)脈縮窄法成功建立慢性心力衰竭動(dòng)物模型，顯示實(shí)驗(yàn)組中QTc較假手術(shù)組QTc明顯延長(zhǎng)，提示存在心肌電重構(gòu)，其心律失常易感性增加。

Figure 2.The protein expression of Kv1.4, Kv4.3 and Cx43 in ventricular myocardium. Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group.

圖2 各組心室肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43的蛋白表達(dá)

瞬時(shí)外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)是心室肌細(xì)胞復(fù)極中的主要外向電流，形成心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位l期。Kv4.3和Kv1.4是Ito通道α亞單位的重要編碼基因[8]。既往研究證實(shí)慢性心力衰竭時(shí)心室肌細(xì)胞Kv4.3和Kv1.4表達(dá)水平下降，Ito密度下降，心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程和VERP延長(zhǎng)。此外Kv4.3和Kv1.4尚可通過影響L型鈣通道、鈉鈣交換體的活性狀態(tài)，調(diào)節(jié)興奮收縮偶聯(lián)過程、心肌收縮性及參與心肌細(xì)胞整個(gè)復(fù)極過程[9-10]。本研究結(jié)果與既往的研究相似，心衰兔心室肌組織Kv4.3和Kv1.4表達(dá)水平下降，VERP明顯延長(zhǎng)。

縫隙連接蛋白廣泛參與心肌細(xì)胞間電、化學(xué)信號(hào)通路傳導(dǎo)?？p隙連接介導(dǎo)的心電沖動(dòng)是維持正常心電功能的重要保障，Cx43為心室肌細(xì)胞的主要連接蛋白，相鄰心肌細(xì)胞之間的電耦聯(lián)即由Cx43所組成的縫隙連接通道主導(dǎo)[11]。Cx43的異常表達(dá)可參與房性及室性心律失常的發(fā)生及維持[12-13]，后續(xù)有基礎(chǔ)研究表明慢性心力衰竭的心室肌組織可出現(xiàn)Cx43的表達(dá)數(shù)量、分布方式和功能發(fā)生改變，即縫隙連接重構(gòu)，對(duì)心室肌電重構(gòu)產(chǎn)生了明顯影響[14]。本研究結(jié)果與既往研究的相似，心衰兔心室肌組織Cx43表達(dá)水平下降。Cx43表達(dá)下降不僅影響心室肌細(xì)胞的傳導(dǎo)性，且在Cx43表達(dá)較低的區(qū)域心肌組織跨壁離散度增大，導(dǎo)致心室肌不同部位的傳導(dǎo)時(shí)間和復(fù)極時(shí)間離散度增加，這與惡性室性心律失常和心源性猝死發(fā)生密切相關(guān)。

心臟收縮力調(diào)節(jié)為新興的非藥物治療心衰方法。Sabbah等[15]首次報(bào)道CCM動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，2001年P(guān)appone等[16]率先將其應(yīng)用于人體研究。目前研究證實(shí)CCM可通過調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)鈣ATP酶、鈉鈣交換蛋白-1、受磷蛋白、雷尼丁受體、細(xì)胞骨架蛋白、基質(zhì)金屬蛋白、P38絲裂原激活蛋白激酶等的表達(dá)或磷酸化水平，增強(qiáng)心肌收縮力，改善心肌重構(gòu)[17]。國(guó)內(nèi)亦有研究應(yīng)用膜片鉗技術(shù)證實(shí)CCM可影響豚鼠心肌細(xì)胞膜鈉鈣交換電流和L型鈣通道電流[18]。2016 ESC急慢性心力衰竭診斷與治療指南中推薦在選擇性心衰患者可應(yīng)用CCM治療[19]。CCM對(duì)于心衰心肌電生理重構(gòu)的影響較少報(bào)道，Winter等[20]指出CCM可增加健康兔離體乳頭肌細(xì)胞Iks電流，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，有可能出現(xiàn)增加心律失常風(fēng)險(xiǎn)，但后續(xù)臨床研究報(bào)道CCM可降低慢性心力衰竭患者死亡率，可能部分獲益與減少惡性室性心律失常的發(fā)作[21]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CCM可通過TGFβ信號(hào)通路改善慢性心力衰竭兔心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，且研究表明心衰兔心肌組織心電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切關(guān)聯(lián)[22]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示慢性心力衰竭兔心室肌Kv1.4、Kv4.3和Cx43的表達(dá)下降可能是其電重構(gòu)的機(jī)制，心臟收縮力調(diào)節(jié)可能調(diào)節(jié)以上基因的表達(dá)，縮短心室肌有效不應(yīng)期，降低QTc離散度，改善慢性心力衰竭兔心室肌電重構(gòu)，為心臟收縮力調(diào)節(jié)的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。后續(xù)仍需進(jìn)一步應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)離子通道功能學(xué)上的變化。