孫治霞， 李 華， 索紅亮

(河南省中醫(yī)院， 河南 鄭州 450002)

心跳驟停是臨床常見的危急重癥，可誘導(dǎo)全腦缺血、缺氧，經(jīng)心肺復(fù)蘇后隨著血液循環(huán)的重建，腦部易出現(xiàn)再灌注損傷，造成腦功能障礙[1]，目前臨床約80%患者會(huì)出現(xiàn)各種后遺癥，約20%患者出現(xiàn)永久性腦損傷，因此，減輕心肺復(fù)蘇后腦損傷是臨床研究的熱點(diǎn)[2]。醒腦灌腸液是由腸黏膜直接吸收進(jìn)入體內(nèi)的中藥湯劑，具有清熱瀉火、涼血逐淤、醒腦開竅的功效[3]，可用于治療急性缺血及出血性腦卒中，減輕患者腦損傷癥狀，加速其蘇醒[4-5]，因而推測(cè)醒腦灌腸液對(duì)心肺復(fù)蘇后大鼠具有腦保護(hù)作用。白細(xì)胞介素33(interleukin-33，IL-33)/生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2，ST2)信號(hào)可調(diào)控Th1/Th2免疫平衡，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與多種心腦血管疾病的發(fā)展[6]，急性腦梗死患者血清IL-33水平顯著高于正常假手術(shù)組，血清IL-33水平會(huì)隨著梗死體積的增加而增加[7]；血清中ST2水平相應(yīng)升高，可影響心肺復(fù)蘇患者的預(yù)后，血清ST2水平高的患者死亡率高于水平低患者[8]；因而IL-33/ST2信號(hào)可能調(diào)節(jié)心肺復(fù)蘇后大鼠的腦損傷過程，但醒腦灌腸液對(duì)IL-33/ST2信號(hào)的影響目前還未知。本項(xiàng)工作采用窒息法建立心肺復(fù)蘇大鼠模型，可較好的反映出心肺復(fù)蘇后腦損傷的臨床病理生理變化，進(jìn)而對(duì)醒腦灌腸液對(duì)心肺復(fù)蘇后大鼠的腦損傷及IL-33/ST2信號(hào)通路的影響進(jìn)行初步研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)藥物

醒腦灌腸液(膽南星15 g，石菖蒲20 g，全瓜蔞20 g，生大黃12 g，梔子10 g，郁金12 g，厚樸15 g，冰片3 g)，由本院藥房提供;烏司他丁(ulinastatin)購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字為H19990134。

2 動(dòng)物

雄性SD大鼠(廣東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，SPF清潔級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0034，體重200～240 g，飼養(yǎng)條件：自然光照，溫度25℃，濕度50%，保持環(huán)境清潔、安靜、通風(fēng)良好，自由飲食、飲水，定期更換墊料、清理消毒鼠籠。

3 試劑

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)，貨號(hào)為IC-SOD-Ra；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)，貨號(hào)為xy-30182；大鼠S100鈣結(jié)合蛋白β亞基(S100 calcium binding protein beta subunit, S100β)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)，貨號(hào)為YS04063B；大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，貨號(hào)為SBJ-R0081；大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒,兔源GAPDH、IL-33和ST2 Ⅰ抗,羊抗兔Ⅱ抗(Abcam)，貨號(hào)分別為ab100768、ab100785、ab181602、ab207737、ab194113和ab150077；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和TBST緩沖液(索萊寶公司)，貨號(hào)分別為P1200和T1081；RIPA裂解液、BCA試劑盒和HE染色試劑盒(上海碧云天公司)，貨號(hào)分別為P0013K、P0011和C0105。

4 儀器

酶標(biāo)儀購(gòu)自Perkin Elmer；蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-Rad；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf；DHX-300動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自成都儀器廠；RM2035輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、EG1160包埋機(jī)和HI1220 烤片機(jī)購(gòu)自Leica; IX70倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus；BSA224S-CW電子天平購(gòu)自Sartorius；制冰機(jī)和恒溫水浴鍋購(gòu)自北京六一儀器廠。

5 方法

5.1動(dòng)物模型制備及分組給藥 參考文獻(xiàn)[9]，以30 mg/kg的劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，仰臥位固定在操作臺(tái)，頸部備皮，噴灑75%乙醇消毒后，用16G鞘管經(jīng)口氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，分離左側(cè)股動(dòng)脈，置入一條留置管監(jiān)測(cè)血壓，在大鼠呼氣末用動(dòng)脈夾夾閉氣管3～4 min，同時(shí)頸靜脈注射0.5 mol/L冰氯化鉀停跳液，直至心電圖QRS波完全消失呈直線，然后以80 min-1通氣頻率、6 mL/kg潮氣量純氧機(jī)械通氣，同時(shí)以180 min-1按壓頻率進(jìn)行人工胸外心臟按壓，直至自主循環(huán)恢復(fù)，即完成心肺復(fù)蘇模型制備，制備70只，死亡10只，成功60只，成功率為85.7%。將其隨機(jī)分為模型(model)組、醒腦灌腸液低劑量(5 mL/kg)組、醒腦灌腸液中劑量(10 mL/kg)組、醒腦灌腸液高劑量組(20 mL/kg)和烏司他丁組，每組12只。另取12只大鼠僅麻醉后暴露、分離氣管后縫合處理，作為假手術(shù)(sham operation)組。各組大鼠均做空腸置管造瘺術(shù)：雙手消毒后，將直徑約1.0 mm的無(wú)菌硅膠管插入幽門，遠(yuǎn)端直到屈氏韌帶下5 cm處，并沿皮下隧道引出至頸背部肩胛間，然后固定，每次灌腸前以微量輸液泵推注2 mL生理鹽水沖洗腸管。參照文獻(xiàn)[10]，膽南星15 g、石菖蒲20 g、全瓜蔞20 g、生大黃12 g、梔子10 g、郁金12 g、厚樸15 g加水500 mL熬制至200 mL藥液，靜置降溫，至37～39 ℃時(shí)加3 g冰片溶解后即可得醒腦灌腸液。進(jìn)行人鼠劑量換算，醒腦灌腸液各劑量組大鼠每天分別以(5、10和20)mL/kg的劑量灌腸治療，并尾靜脈注射與烏司他丁組相同劑量的生理鹽水；烏司他丁組大鼠以50 000 U/kg[11]的劑量尾靜脈注射治療，并以20 mL/kg劑量的生理鹽水進(jìn)行灌腸；假手術(shù)組與模型組大鼠，尾靜脈注射與烏司他丁組相同劑量的生理鹽水，并以20 mL/kg劑量的生理鹽水灌腸，每次1 d，持續(xù)治療7 d。

5.2大鼠神經(jīng)功能缺損檢測(cè)及標(biāo)本收集 末次給藥24 h后，觀察各組大鼠活動(dòng)情況，以Longa分級(jí)法[12]對(duì)其神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分，其中無(wú)神經(jīng)功能缺損為0分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分，行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分，行走向?qū)?cè)傾倒為3分，意識(shí)喪失，不能自發(fā)行走為4分，死亡為5分。各組大鼠經(jīng)尾靜脈取血2 mL，靜置15 min，3 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液儲(chǔ)存在-80℃?zhèn)溆?。各組大鼠分別取6只斷頭處死后，分離腦組織，剪約1.5 g儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆茫Ｓ嘟M織以4%多聚甲醛固定后，經(jīng)脫水、透明后石蠟包埋，切片機(jī)病理切片備用。

5.3大鼠腦組織含水量檢測(cè)及HE染色 各組剩余6只大鼠斷頭處死后，分離腦組織，稱量得濕重，然后放入烘干機(jī)中烘干至質(zhì)量不再變化，稱量得干重，腦組織含水量(%)=(濕重-腦干重)/濕重×100%。將方法5.2中的病理切片脫蠟、梯度乙醇(由高到低)浸泡后以HE試劑盒染色，具體操作參照說(shuō)明書，經(jīng)再次脫水、透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理改變情況。

5.4大鼠血清S100β和NSE水平檢測(cè) 方法5.2中的血清4 ℃解凍，采用大鼠S100β和NSE ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清S100β和NSE水平，具體操作參照說(shuō)明書。

5.5大鼠腦組織SOD、MDA、IL-1β和TNF-α水平檢測(cè) 方法5.2中的腦組織取約1 g加入RIPA裂解液，4 ℃勻漿得勻漿液，1 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，采用SOD、MDA檢測(cè)試劑盒及IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)腦組織SOD、MDA、IL-1β和TNF-α水平，具體操作參照說(shuō)明書。

5.6大鼠腦組織IL-33和ST2蛋白表達(dá)檢測(cè) 方法5.2中的腦組織取約0.5 g加入RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制劑)，在勻漿機(jī)冰浴中勻漿得勻漿液，1 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，采用BCA試劑盒測(cè)得各組蛋白總劑量，具體操作參照說(shuō)明書。根據(jù)結(jié)果取含有相同質(zhì)量總蛋白的各組樣品液進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，以IL-33和ST2兔源Ⅰ抗(1 ∶2 000) 4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，以羊抗兔Ⅱ抗(1 ∶1 000) 室溫孵育2 h，TBST漂洗，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Quantity One軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示；計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 醒腦灌腸液對(duì)大鼠腦損傷的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常、完好，無(wú)損傷；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)紊亂，局灶出血，神經(jīng)元核收縮、凋亡等病理?yè)p傷；醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織病理?yè)p傷減輕，見圖1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低(P<0.05)，且醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 1.HE staining results of brain tissues of rats in each group. A: sham operation group; B: model group; C: low-dose Xingnao enema fluid group; D: middle-dose Xingnao enema fluid middle dose group; E: high-dose Xingnao enema fluid group; F: ulinastatin group.

圖1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果

Figure 2.Neurological deficit score of rats in each group. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

2 醒腦灌腸液對(duì)大鼠腦組織含水量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織含水量降低(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

3 醒腦灌腸液對(duì)大鼠血清中S100β和NSE水平影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中S100β和NSE水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠血清中S100β和NSE水平降低(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4、5。

Figure 3.Water content in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠腦組織含水量

Figure 4.Serum levels of S100β in rats of each group. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖4 各組大鼠血清中S100β水平

4 醒腦灌腸液對(duì)大鼠腦組織中SOD和MDA水平影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織中MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6、圖7。

Figure 5.Serum levels of NSE in rats of each group. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖5 各組大鼠血清中NSE水平

Figure 6.Levels of SOD in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖6 各組大鼠腦組織中SOD水平

Figure 7.Levels of MDA in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖7 各組大鼠腦組織中MDA水平

5 醒腦灌腸液對(duì)大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α水平影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖8。

Figure 8.Levels of IL-1β and TNF-α in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖8 各組大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α水平

6 醒腦灌腸液對(duì)大鼠腦組織中IL-33和ST2蛋白表達(dá)影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中IL-33和ST2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織中IL-33和ST2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖9。

Figure 9.Relative protein expression of IL-33 and ST2 in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖9 各組大鼠腦組織中IL-33和ST2的蛋白表達(dá)

討 論

心肺復(fù)蘇后機(jī)體大腦會(huì)經(jīng)歷無(wú)血流到低血流再到恢復(fù)正常血流的過程，可導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)多種復(fù)雜的病理改變，引起神經(jīng)細(xì)胞功能障礙和死亡，嚴(yán)重威脅患者神經(jīng)功能恢復(fù)[13]。醒腦灌腸液作為一種中藥方劑，含有多種中藥成分，其中膽南星、石菖蒲、冰片味辛、香、涼，可活血通經(jīng)、開竅醒腦；厚樸、梔子和大黃可通氣化痰，清熱瀉火；全瓜蔞、大黃、郁金能開竅解郁，通腑化痰，該方劑可降低血管通透性、清除自由基、減輕腦水腫，進(jìn)而促進(jìn)大腦蘇醒，且對(duì)肝性腦病的臨床療效顯著[14-15]，推測(cè)可能也可治療心肺復(fù)蘇后腦損傷。烏司他丁作為一種由人尿液提取的廣譜胰蛋白酶抑制劑，可通過降低腦組織IL-1β和TNF-α等促炎因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到腦保護(hù)作用，在心肺腦復(fù)蘇治療中具有較好的療效，因而本項(xiàng)工作選擇烏司他丁作為陽(yáng)性對(duì)照藥[16]。

本研究顯示，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)紊亂、局灶出血、神經(jīng)元核收縮、凋亡等病理改變，神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織含水量顯著高于假手術(shù)組。此結(jié)果表明大鼠心臟驟停后心肺復(fù)蘇恢復(fù)自主循環(huán)，腦組織會(huì)因炎癥反應(yīng)出現(xiàn)局灶出血和神經(jīng)元凋亡等病理改變，損害神經(jīng)功能，造成腦損傷。S100β和NSE是判斷腦損傷的敏感指標(biāo)，其中S100β是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，多位于星形膠質(zhì)細(xì)胞中，神經(jīng)細(xì)胞受損后會(huì)通過功能受損的血腦屏障進(jìn)入血液中；NSE廣泛分布于神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中，當(dāng)血腦屏障功能受損后也可進(jìn)入血液系統(tǒng)中[17-18]。腦組織在心肺復(fù)蘇過程中可產(chǎn)生大量氧自由基，引起腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損、凋亡，SOD是機(jī)體中的超氧化物歧化酶，可清除自由基，降低氧化應(yīng)激；細(xì)胞中脂肪酸過氧化可生成MDA，其含量與脂質(zhì)過氧化程度正相關(guān)，兩者水平高低可反映機(jī)體組織氧化應(yīng)激程度[19-20]。而本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中S100β和NSE顯著高于假手術(shù)組；腦組織中MDA、IL-1β和TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組，SOD水平顯著低于假手術(shù)組，表明模型大鼠出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，造成腦損傷，模型制備成功。而經(jīng)藥物治療后，大鼠腦組織病理?yè)p傷減輕，神經(jīng)功能缺損評(píng)分，腦組織含水量，血清中S100β和NSE，腦組織中MDA、IL-1β和TNF-α水平均降低，SOD水平升高，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性且醒腦灌腸液高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照藥烏司他丁組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明醒腦灌腸液可減輕心肺復(fù)蘇大鼠氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，修復(fù)腦損傷，恢復(fù)神經(jīng)功能，揭示其對(duì)心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能具有保護(hù)作用。烏司他丁作為臨床常用的促使腦復(fù)蘇藥物，會(huì)有粒細(xì)胞減少、腹瀉、肝損傷和過敏等不良反應(yīng)，且費(fèi)用較高，而醒腦灌腸液作為中藥制劑，不良反應(yīng)少，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，為心肺復(fù)蘇后腦損傷的臨床治療提供了參考資料。

研究表明，IL-33/ST2信號(hào)通路參與心肌梗死、腦梗死后組織損傷過程，缺血再灌注損傷后血清中IL-33和ST2水平可上調(diào)[21]。IL-33/ST2L信號(hào)屬于力學(xué)激活系統(tǒng)，可抑制心臟纖維化及心肌細(xì)胞肥大，發(fā)揮心臟保護(hù)作用；另外，sST2作為誘騙受體可特異性結(jié)合IL-33，阻斷IL-33與ST2L結(jié)合，進(jìn)而阻止IL-33/ST2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織IL-33和ST2蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，醒腦灌腸液各劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織IL-33和ST2蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性且醒腦灌腸液高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照藥烏司他丁組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明IL-33/ST2信號(hào)可能參與了心肺復(fù)蘇后腦損傷過程，醒腦灌腸液保護(hù)心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能的作用機(jī)制可能是下調(diào)該信號(hào)通路，推測(cè)IL-33/ST2信號(hào)可能是醒腦灌腸液保護(hù)心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能的作用靶點(diǎn)，但是具體內(nèi)在機(jī)制尚不明確。

綜上所述，醒腦灌腸液可減輕心肺復(fù)蘇后大腦氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，修復(fù)恢復(fù)受損神經(jīng)功能，在心肺復(fù)蘇后腦損傷過程中IL-33/ST2信號(hào)上調(diào)，醒腦灌腸液可下調(diào)其表達(dá)保護(hù)腦組織，這可能是其藥理機(jī)制，但本研究只進(jìn)行了初步探索，未特異性干預(yù)IL-33/ST2信號(hào)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，其深入的分子機(jī)制還有待后續(xù)研究。