付 曉， 李 慕， 文 平

(邵陽學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖南 邵陽 422000)

不可分型流感嗜血桿菌(nontypeableHemophilusinfluenzae，NTHi)是一種革蘭陰性致病菌，其廣泛分布于上、下呼吸道內(nèi)，是引起人類呼吸道感染性疾病的主要原因之一[1]。NTHi可導(dǎo)致包括急性中耳炎、囊性纖維化以及獲得性肺炎等在內(nèi)的呼吸道疾病，同時(shí)也可引起慢性支氣管炎和慢性下呼吸道阻塞性肺病等慢性疾病[2]。此外，NTHi還是發(fā)展中國(guó)家兒童住院的最常見病因[3]。然而，由于NTHi不含莢膜且具有獨(dú)特的耐藥機(jī)制，到目前為止我們?nèi)圆磺宄﨨THi具體的致病機(jī)制[4]。而考慮到NTHi在臨床的高發(fā)病率，探究NTHi的致病機(jī)制對(duì)于預(yù)防治療NTHi引起的疾病至關(guān)重要。

組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)是一類能夠修飾染色體結(jié)構(gòu)并調(diào)控基因表達(dá)的重要蛋白酶[5]。研究表明，組蛋白乙?；軌虼龠M(jìn)DNA與組蛋白八聚體的解離，從而使轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，進(jìn)而激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[6]。目前已經(jīng)證實(shí)，HDAC能夠顯著下調(diào)某些炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7]。但HDAC在NTHi引起呼吸道炎癥反應(yīng)中的作用尚未明確。本研究中，我們對(duì)NTHi感染支氣管上皮細(xì)胞后的炎癥反應(yīng)分子機(jī)制進(jìn)行了體外研究，旨在為進(jìn)一步完善NTHi的致病機(jī)制提供參考。

材 料 和 方 法

1 菌株與細(xì)胞株

不可分型流感嗜血桿菌(ATCC-49247)購(gòu)自ATCC；人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B購(gòu)自中科院細(xì)胞庫。

2 主要實(shí)驗(yàn)材料

人白細(xì)胞介素8 (interleckin-8, IL-8)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen；核蛋白和細(xì)胞核提取試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher；HDAC活性檢測(cè)試劑盒和染色質(zhì)免疫沉淀試劑盒購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司；抗IκBα、Ac-H3、Ac-H4、HDAC1和HDAC2抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；NF-κB抑制劑BAY 11-7082和HDAC抑制劑trichostatin A(TSA)購(gòu)自Santa Cruz；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自上海生物工程股份有限公司。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)與NTHi感染 BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入1%的青霉素-鏈霉素混合液后于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48 h待細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80%～90%時(shí)，加入MOI=10的NTHi后，分別于感染后0、4、8、12、16和24 h收集細(xì)胞以及細(xì)胞上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子 按照上述處理后收集細(xì)胞上清，并按照人IL-8和GM-CSF ELISA 試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞上清中IL-8和GM-CSF的含量。最后用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞樣本的吸光度(A)值，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最后通過試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各細(xì)胞上清中IL-8和GM-CSF的濃度。

3.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 收集處理后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，隨后進(jìn)行RNA純化并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。轉(zhuǎn)錄完成后按照30 μL的qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。IL-8的上游引物序列為5’-AGCTCTGTGTGAAGGTGCAGT-3’，下游引物序列為5’-AATTTCTGTGTTGGCGCAGT-3’；GM-CSF的上游引物序列為5’-GAACGAAAAGAACGAAGACGTAG-3’，下游引物序列為5’-TTATGAAATCCTCAAAGGTGGTG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，下游引物序列為5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。擴(kuò)增完畢后，使用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-8和GM-CSF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3.4Western blot檢測(cè) 收集處理后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE，并于10 V條件下轉(zhuǎn)膜儀中轉(zhuǎn)膜40 min。轉(zhuǎn)膜完成后于5%脫脂奶粉中封閉過夜。隨后用稀釋好的Ⅰ抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后，再加入稀釋好的Ⅱ抗室溫孵育1 h。TBST洗膜5次后于顯影儀中進(jìn)行ECL發(fā)光顯影。

3.5電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA) 收集處理后的細(xì)胞，采用核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白。隨后按照說明書要求將細(xì)胞核提取物與探針標(biāo)記的寡核苷酸混合后37℃反應(yīng)10 min。反應(yīng)完成后，加入終止液終止反應(yīng)并進(jìn)行SDS-PAGE，最后通過紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

3.6染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè) 收集處理后的BEAS-2B細(xì)胞，按照染色質(zhì)免疫沉淀試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。具體操作如下：在細(xì)胞中細(xì)胞加入0.5 mL 37%的甲醛，37 ℃孵育10 min。隨后加甘氨酸至終濃度為0.125 mol/L?；靹蚝螅谑覝叵路胖? min。超聲破碎細(xì)胞后離心收集沉淀，隨后加入相應(yīng)抗體進(jìn)行PCR分析。

3.7HDAC活性檢測(cè) BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)過上述處理后，采用細(xì)胞核提取試劑盒提取BEAS-2B細(xì)胞核。并按照HDAC活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，最后通過熒光顯微鏡檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，以計(jì)算HDAC活性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)分析均采用SPSS 18.0軟件。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)比較均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NTHi誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)IL-8和GM-CSF

MOI=10的NTHi感染BEAS-2B細(xì)胞0、4、12和24 h后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-8和GM-CSF的表達(dá)水平。ELISA結(jié)果顯示，細(xì)胞上清中IL-8和GM-CSF分泌水平顯著上升(P<0.05),見圖1A、B。而RT-qPCR結(jié)果與ELISA結(jié)果相同，NTHi感染4 h后，細(xì)胞內(nèi)IL-8和GM-CSF的mRNA表達(dá)水平也顯著增高(P<0.05),見圖1C。

Figure 1.The expression of IL-8 and GM-CSF in the bronchial epithelial cells induced by NTHi. A and B: the levels of IL-8 and GM-CSF were detected by ELISA; B: the mRNA expression of IL-8 and GM-CSF was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group．

圖1 NTHi誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)IL-8和GM-CSF

2 NTHi誘導(dǎo)IL-8和GM-CSF分泌與NF-κB有關(guān)

Western blot結(jié)果顯示，NTHi感染BEAS-2B細(xì)胞30和60 min后，胞漿內(nèi)總IκBα的表達(dá)顯著下調(diào)，見圖2A；而EMSA結(jié)果也顯示，NTHi感染60和120 min可顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性，見圖2B；進(jìn)一步采用10 μmol/L NF-κB抑制劑BAY 11-7082預(yù)處理后，BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)GM-CSF和IL-8的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見圖2C。

3 NTHi誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞組蛋白磷酸乙?；?/h3>

Western blot檢測(cè)NTHi感染后細(xì)胞內(nèi)的組蛋白磷酸乙?；?。結(jié)果顯示，NTHi感染BEAS-2B細(xì)胞60和120 min可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3和H4的磷酸乙?；?見圖3A。而染色質(zhì)共沉淀結(jié)果也顯示，NTHi感染可促進(jìn)IL-8和RNA聚合酶II的結(jié)合，見圖3B。

4 NTHi下調(diào)BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)HDAC表達(dá)與活性

MOI=10的NTHi感染4、8和16 h后，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HDAC的表達(dá)水平,結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)HDAC1和HDAC2的表達(dá)水平均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低,見圖4A。酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，NTHi感染8和16 h后，細(xì)胞內(nèi)HDAC的酶活性均顯著降低(P<0.05)，見圖4B。進(jìn)一步采用10 μg/L HDAC抑制劑TSA預(yù)處理后NTHi感染細(xì)胞,結(jié)果顯示，相較于未處理組，TSA預(yù)處理的細(xì)胞內(nèi)IL-8分泌水平顯著上升(P<0.05)，見圖4C。

Figure 2.The effect of NF-κB signaling pathway on the secretion of IL-8 and GM-CSF. A: the expression of IκBα was detected by Western blot; B: the DNA binding activity of NF-κB was detected by EMSA; C: the mRNA expression of IL-8 and GM-CSF was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05 24 h group．

圖2 NF-κB信號(hào)通路對(duì)IL-8與GM-CSF分泌的影響

Figure 3.NTHi induced phosphoacetylation of histones in BEAS-2B cells. A: the phosphoacetylation of histones H3 and H4 in the BEAS-2B cells was detected by Western blot; B: the binding activity of IL-8 and RNA polymerase Ⅱ was detected by chromatin immunoprecipitation.

圖3 NTHi誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞組蛋白磷酸乙?；?/p>

討 論

NTHi作為廣泛存在于人體的條件致病菌，其可通過不同的機(jī)制入侵至呼吸道上皮細(xì)胞。而上皮細(xì)胞作為固有免疫的重要組成部分，其可通過促進(jìn)趨化因子和炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮致炎作用[8]。鑒于NTHi誘導(dǎo)上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制復(fù)雜，探究NTHi對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的致炎機(jī)制十分必要。

炎癥反應(yīng)是NTHi發(fā)揮致病作用的關(guān)鍵，過度炎癥反應(yīng)可使細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，并引發(fā)相關(guān)的病理反應(yīng)導(dǎo)致炎性損傷[9]。本研究中，NTHi感染支氣管上皮細(xì)胞能顯著誘導(dǎo)炎癥因子IL-8和GM-CSF的分泌，提示細(xì)胞因子和趨化因子的分泌可能是NTHi所致炎癥反應(yīng)的重要因素。而考慮到之前已有研究證實(shí)NTHi可通過MAPK誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞分泌炎癥因子IL-8[10]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與之相符。

Figure 4.NTHi down-regulated the expression and activity of HDAC in BEAS-2B cells. A: the expression of HDAC1 and HDAC2 were detected by Western blot; B: the activity of HDAC in BEAS-2B cell was detected by enzyme activity assay; C: the le-vel of IL-8 was detected by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsNTHi group.

圖4 NTHi下調(diào)BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)HDAC表達(dá)與活性

既往研究表明，NTHi在誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌促炎因子分泌過程中受p38和ERK等通路調(diào)控[10]。但由于NTHi致炎機(jī)制較為復(fù)雜，因此必定還存在其他調(diào)控機(jī)制。本研究中，NTHi感染可顯著下調(diào)胞漿內(nèi)總IκBα的表達(dá)，并顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性，提示NF-κB信號(hào)通路被激活。而NF-κB抑制劑同樣能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)GM-CSF和IL-8的表達(dá)水平，證實(shí)NF-κB參與了細(xì)胞因子的調(diào)控。而考慮到之前有研究證實(shí)NTHi可通過Toll樣受體2激活NF-κB通路誘導(dǎo)促炎因子IL-8的分泌[11]，本結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。

研究表明[12]，組蛋白乙?；揎椖軌虼龠M(jìn)促炎相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。而在其它呼吸道致病菌感染的支氣管上皮細(xì)胞中，其組蛋白H3和H4的乙?；揭诧@著增加[13]。本研究中NTHi感染的細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3和H4的磷酸乙?；斤@著提高，且IL-8和RNA 聚合酶II結(jié)合增加。Feng等[14]研究發(fā)現(xiàn)呼吸道合胞病毒感染支氣管上皮細(xì)胞可使H3發(fā)生去乙?；?，并最終引發(fā)氣道炎癥。同時(shí)他們也發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑能夠有效地逆轉(zhuǎn)組蛋白H3的去乙?；?，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。這也就可以解釋本研究結(jié)果：支氣管上皮細(xì)胞通過發(fā)生組蛋白乙酰化，進(jìn)而促進(jìn)炎癥相關(guān)分子與介質(zhì)的表達(dá)。

本研究顯示，在NTHi感染的細(xì)胞內(nèi)HDAC1和HDAC2的表達(dá)水平均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降，而酶活性也顯著降低。研究表明，HDAC可誘導(dǎo)乙?；磻?yīng)，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路的活化[15]，這可能是由于乙酰化可發(fā)生于NF-κB的不同賴氨酸位點(diǎn)[16]。這也可以解釋為什么NTHi可通過抑制NF-κB信號(hào)通路抑制組蛋白去乙?；瘉泶龠M(jìn)上皮細(xì)胞炎癥。

綜上所述，本研究初步證實(shí)NTHi感染支氣管上皮細(xì)胞后能夠通過激活NF-κB信號(hào)通路抑制HDAC的表達(dá)活性，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-8和GM-CSF的分泌。但由于炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，NTHi誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否還存在其它作用機(jī)制目前尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。