孫云波 沈碩 張創(chuàng)峰

[摘要] 目的 建立紅景天的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)，同時(shí)對(duì)不同批次紅景天的質(zhì)量進(jìn)行研究。 方法 采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，以Waters Xbridge？誖 Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）為色譜柱、乙腈-0.1%冰醋酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長為276 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣體積為10 μL，記錄時(shí)間為70 min。 結(jié)果 HPLC指紋圖譜的方法學(xué)考察符合相關(guān)要求，共標(biāo)定紅景天藥材HPLC指紋圖譜的17個(gè)共有峰，指認(rèn)其中紅景天苷、沒食子酸、咖啡酸、酪醇、對(duì)香豆酸、原兒茶酸、兒茶酸、香草醛、異槲皮苷、槲皮苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷和山奈酚12個(gè)特征峰，13批紅景天藥材指紋圖譜的相似度在0.863～0.984。 結(jié)論 所建立的紅景天HPLC指紋圖譜可為紅景天質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 紅景天;高效液相色譜指紋圖譜;紅景天苷;相似度;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

[中圖分類號(hào)] R927.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）02（a）-0023-05

[Abstract] Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of Herba Rhodiolae， and to provide the basis for the establishment of quality standards， and at the same time， to study the quality of different batches of Herba Rhodiolae. Methods RP-HPLC method was used. Waters Xbridge？誖 Shield RP18 （5 μm， 4.6 mm×250 mm） wan used as the column， acetonitrile-water containing 0.1% acetic acid was used as the mobile phase of the gradient elute， with the detection wavelength of 276 nm and the colomn temperature maintained at 30℃. The flow rate was 1.0 mL/min. The recording time was 70 min. Results The HPLC fingerprint method validation met the technical standards. A total of 17 common peaks of Herba Rhodiolae. were found. A total of 12 characteristic peak were identified. They were salidroside， callic acid， caffeic aci， tyrosol， p-coumaric acid， protocatechuic acid， catechin， vanillin， isoquercitrin， quercitrin， chrysophanol 8-O-β-D-glucoside， kaempferol， respectively. The similarity of 13 differernt batches of Herba Rhodiolae. was among 0.863-0.984. Conclusion The specific HPLC fingerprint can be used as a method of scientific evaluation for Herba Rhodiolae. crenulata.

[Key words] Herba Rhodiolae; High performance liquid chromatography figerprint chromatograms; Salidroside; Similarity; Quality standard

紅景天為景天科大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H. Ohba的干燥根和根莖[1]。其味甘、苦，性平，歸肺、心經(jīng)[2]。常用于控制高原反應(yīng)，治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和消除疲勞[3-4]。紅景天還具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和激活磷酸酰肌醇激酶/絲氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種藥理的作用[4-13];紅景天的化學(xué)成分較為復(fù)雜，主要為多糖類、甾醇類、鞣酸類和黃酮等[14-16]，它們共同構(gòu)成了紅景天的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，通常以紅景天苷（含量不得少于0.50%）作為其質(zhì)量控制的唯一標(biāo)示性成分[1]。然而由于中藥材成分的復(fù)雜性，單一成分不足以全面反映紅景天的內(nèi)在質(zhì)量;指紋圖譜技術(shù)是從藥材的整體物質(zhì)基礎(chǔ)角度出發(fā)，系統(tǒng)把握藥材質(zhì)量的一種分析技術(shù)手段，為藥材質(zhì)量的有效把控提供了一種可靠的質(zhì)控方法[17-27]。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)紅景天藥材質(zhì)量進(jìn)行了研究，建立了紅景天的指紋圖譜，為公司順利通過連花清瘟膠囊美國食品和藥物管理局（FDA）二期臨床提供更可靠的原藥材質(zhì)量支持，同時(shí)為提高紅景天藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀（PDA檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器;Empower Pro色譜工作站）（美國Waters）;AL204型萬分之一及AB135-S型十萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）;KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;色譜柱Waters Xbridge？誖 Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm） （美國Waters）;DL-5200B-Ⅱ型低速大容量多管離心機(jī)離心半徑為19.6 cm（上海安亭科學(xué)儀器廠）;Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國密理博公司）;0.45 μm微孔濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

紅景天苷（批號(hào)：1001210553，美國sigma）;沒食子酸（批號(hào)：1110831-201605，中國食品藥品檢定研究院）;酪醇（批號(hào)：111676-200602，中國藥品生物制品檢定所）;咖啡酸（批號(hào)：1001098874，美國sigma）;對(duì)香豆酸（批號(hào)：112037-201801，中國食品藥品檢定研究院）;原兒茶酸（批號(hào)：809-200102，中國藥品生物制品檢定所）;兒茶酸（批號(hào)：13051511，成都生物化工有限公司）;香草醛（批號(hào)：20180712，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）;異槲皮苷（批號(hào)：111809-201403，中國食品藥品檢定研究院）;槲皮苷（批號(hào)：111538-200504，中國藥品生物制品檢定所）;大黃酚-8-O-葡萄糖苷（批號(hào)：B20239，上海源葉生物科技有限公司）;山奈酚（批號(hào)：1354900，USP 12601 Twinbrook Pkwy，Rockville， MD.）;甲醇（色譜純，美國Fisher）;乙腈（色譜純，美國Fisher），其余試劑均為分析純，水為超純水。

紅景天藥材經(jīng)石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司中藥資源部崔旭盛高級(jí)工程師鑒定為大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H. Ohba。藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Xbridge？誖Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B）;梯度洗脫見表2;柱溫：30℃;檢測(cè)波長為276? nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

稱定紅景天粉末（過三號(hào)篩）約1 g，精密加入75%甲醇20 mL于50 mL具塞錐形瓶中，稱定重量，超聲提取（功率500 W，頻率40 kHz）15 min，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，3500 r/min離心5 min，取上清液0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱定各對(duì)照品適量，置具塞容量瓶中，加75%甲醇溶解，超聲5 min并制成每1 mL 75%甲醇中含紅景天苷、酪醇、兒茶素、大黃酚-8-O-葡萄糖苷對(duì)照品約0.50 mg，香草醛、對(duì)香豆酸、異槲皮苷、槲皮苷、山奈酚對(duì)照品約1.00 mg，沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸約1.50 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)? 取供試品溶液R8，連續(xù)進(jìn)樣6次，各色譜峰的相對(duì)（2號(hào)紅景天苷）保留時(shí)間的RSD均<0.26%，相對(duì)峰面積的RSD均<4.35%，所得的色譜圖的相似度分別為0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.998，RSD為0.06%，儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取供試品溶液R8，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，各共有有色譜峰的相對(duì)（2號(hào)紅景天苷）保留時(shí)間的RSD均<0.34%，相對(duì)峰面積的RSD均<5.55%，所得的色譜圖的16個(gè)共有峰的相似度分別為0.997、0.999、0.999、0.999、0.995、0.996、1.000、 0.997，RSD為0.18%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)? 取樣品R8，平行制備6份供試品溶液，測(cè)定，各共有色譜峰的相對(duì)（2號(hào)紅景天苷）保留時(shí)間的RSD均<0.34%，相對(duì)面積的RSD均<2.17%，所得的色譜圖的相似度分別為0.999、0.999、0.999、 1.000、1.000、0.998，RSD為0.08%，本方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

13個(gè)不同批次的紅景天HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，共有近30個(gè)共有峰，見圖1。選取分離度較好、響應(yīng)值較高的共有峰中17個(gè)色譜峰作為評(píng)價(jià)紅景天藥材質(zhì)量的共有峰。

1：沒食子酸;2：紅景天苷;3：原兒茶酸;4：酪醇;5：兒茶素;6：咖啡酸;7：香草醛;10：對(duì)香豆酸;11：異槲皮苷;15：槲皮苷;16：大黃酚-8-O-葡萄糖苷;17：山奈酚

確定17個(gè)共有峰后，將對(duì)照品溶液色譜峰的保留時(shí)間與供試品溶液色譜峰的保留時(shí)間及紫外吸收光譜圖進(jìn)行比對(duì)（圖1）。被鑒定的供試品溶液中12個(gè)色譜峰的紫外圖譜（圖2），其中以峰面積較大，出峰穩(wěn)定的2號(hào)色譜峰紅景天苷為參照峰，采用國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012. 130723版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)并建立共有模式，生成不同批次紅景天藥材樣品疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜（圖3），將生成的對(duì)照?qǐng)D譜（R）的相似度值定為1，計(jì)算各批紅景天藥材樣品指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示其相似度為0.863～0.984。見表3。

2.6 指紋圖譜分析

由匹配結(jié)果可知，13批紅景天藥材相似度較好，指紋圖譜含有17個(gè)共有峰，以2號(hào)紅景天苷為參照峰（S），計(jì)算各共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間平均值見表4。將相對(duì)保留時(shí)間的平均值作為規(guī)定值，13批紅景天指紋圖譜17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間均在規(guī)定值±5%范圍內(nèi)。

3 討論

本研究采用二極管陣列（PDA）檢測(cè)器在全波長范圍內(nèi)進(jìn)行樣品分析，其中276 nm下檢測(cè)的色譜圖中色譜峰最多，峰值較大，且基線也較為平穩(wěn)。因此確定檢測(cè)波長為276 nm。

考察了3個(gè)品牌的5種不同的色譜柱，考慮到各色譜峰峰形、分離度及色譜柱應(yīng)用的廣泛性，本研究選擇Waters Xbridge？誖Shield RP18色譜柱。同時(shí)比較了不同流動(dòng)相及色譜柱柱溫對(duì)所得的指紋圖譜色譜圖的影響，結(jié)果顯示，在柱溫30℃時(shí)，以乙腈-0.1%冰醋酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，色譜圖中的色譜峰信息容量較大且分離效果最好。將此分離方法的時(shí)間延長至2倍（140 min），結(jié)果顯示，70 min后無其他色譜峰出現(xiàn)，從而確定梯度洗脫時(shí)間為70 min。

在提取工藝優(yōu)化過程中，以不同比例分?jǐn)?shù)的甲醇和乙醇作為溶媒，分別對(duì)提取方式和時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，75%甲醇超聲15 min得到的色譜峰信息最佳。因此，采用該方法進(jìn)行樣品的提取。

本研究采用HPLC-PDA法梯度洗脫建立了紅景天指紋圖譜，同時(shí)對(duì)色譜條件和供試品溶液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了方法學(xué)考察;其相對(duì)保留時(shí)間-精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD均<0.4%。且建立了紅景天藥材指紋圖譜共有模式，為公司順利通過連花清瘟膠囊FDA二期臨床提供更可靠的原藥材質(zhì)量支持，同時(shí)為提高紅景天藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：154-155.

[2]? 國家食品藥品監(jiān)督管理總局執(zhí)業(yè)藥師資格認(rèn)證中心.中藥專業(yè)知識(shí)（二）[M].7版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：131.

[3]? 周江韜，許磊，陳燕燕，等.紅景天屬植物的化學(xué)成分[J].中國藥學(xué)：英文版，2014，23（7）：433-445.

[4]? 黃鈺芳.紅景天活性成分及藥理作用[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2008，20（5）：528-530.

[5]? 林曉月，孫新.紅景天抗衰老作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志，2018，38（13）：3299-3300.

[6]? 吳秀專，畢曉華，王燕芳，等.紅景天苷藥理作用研究進(jìn)展概述[J].中國藥師，2018，21（8）：1460-1462，1505.

[7]? 孫許濤，柳穎，姜德友，等.紅景天藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2017，45（6）：119-122.

[8]? 蒲位凌，李文華，白茹玉，等.紅景天及其抗炎和抗腫瘤活性成分藥理作用研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥，2017，34（12）：856-859.

[9]? 楊逸成，呂泰標(biāo)，梁棟國，等.紅景天苷干預(yù)疾病的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（2）：371-377.

[10]? 梁光彬，吳格怡，黎雄斌，等.紅景天對(duì)OSAHS相關(guān)的PAH患者心功能的輔助治療作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2018， 56（10）：42-44，49.

[11]? 余磊.紅景天苷藥理作用的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2017， 29（9）：18-21.

[12]? Chen C，Song JB，Chen M，et al. Rhodiola rosea extends lifespan and improves stress tolerance in silkworm，Bombyx mori [J]. Biogerontology，2016，17（2）：373-381.

[13]? Thu OK，Spigset O，Nilsen OG，et al. Effect of commercial Rhodiola rosea on CYP enzyme activity in humans [J]. Eur J Clin Phar，2016，72（3）：295-300.

[14]? 呂秀梅，范芳芳，文檢，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定3種紅景天藥材中5種化學(xué)成分的含量[J].中國藥房，2018，29（18）：2515-2519.

[15]? 圖蓀古麗·托合提，萬傳星.紅景天根莖化學(xué)成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，30（3）：33-38.

[16]? 郭增軍，譚林，徐穎，等.小叢紅景天總黃酮抗氧化活性研究[J].中藥材，2011，34（1）：104-107.

[17]? 謝培山.中藥色譜指紋圖譜[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[18]? 許蓉蓉，林華，秦慶芳，等.金嗓子喉片揮發(fā)性成分氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜分析[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，37（11）：1386-1388.

[19]? 劉敏，范蕾，陳桂云，等.降脂舒心合劑HPLC指紋圖譜的建立及制劑安全性項(xiàng)目的影響因素檢測(cè)[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，16（9）：117-122.

[20]? 趙青舟，劉文蘭，曹麗.中藥復(fù)方一貫煎HPLC指紋圖譜研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，20（12）：51-55.

[21]? Pedan V，Weber C，Do T，et al. HPTLC fingerprint profile analysis of cocoa proanthocyanidins depending on origin and genotype [J]. Food Chemistry，2018，267（30）：277-287.

[22]? Xie RF，Zhao QH，Li ZC，et al. Comparison on HPLC Fingerprints between Fraxini Cortex and Its Eye Drop [J]. Chinese Herbal Med，2013，5（4）：301-306.

[23]? 李蕓，張立軍，戴海蓉，等.高烏頭不同溶劑萃取部位HPLC多波長特征圖譜研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2018，29（5）：630-636.

[24]? 徐妍，楊華蕊，楊永壽，等.中藥特征圖譜研究現(xiàn)狀及展望[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（76）：91-94.

[25]? 陳育鵬，趙倩，王貴金，等.連花清瘟膠囊超高效液相指紋圖譜研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2017，12（24）：77-80.

[26]? 孫云波，沈碩，宋聯(lián)強(qiáng)，等.草麻黃HPLC特征圖譜研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2018，12（25）：67-70.

[27]? 俞潔東，曾海松，吳革林，等.脈絡(luò)通顆粒HPLC指紋圖譜研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，16（4）：39-42.

（收稿日期：2019-08-19? 本文編輯：劉永巧）