楊童玲 夏愛梅 胡曉靜 余艮珍 史 歡 顧 鶯 張曉波 王傳清 張崇凡

黃國(guó)英1

流感病毒檢測(cè)最常見的是采集呼吸道標(biāo)本，可采用拭子、刷子、吸出物和灌洗液獲取呼吸道標(biāo)本，可以采集鼻咽、口咽、鼻孔等。曾使用培養(yǎng)法或直接法熒光抗體法進(jìn)行檢測(cè)[1,2]，現(xiàn)以逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法，可以通過(guò)樣本中少量的病毒核酸擴(kuò)增而提高檢測(cè)率[3]。急性嚴(yán)重呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)感染流行期間，RT-PCR是SARS-CoV-2感染確診的首選方法[4,5]。檢測(cè)準(zhǔn)確性最高的標(biāo)本是下呼吸道標(biāo)本，但屬于有創(chuàng)性操作。由于核酸擴(kuò)增檢測(cè)可以檢測(cè)更低濃度的病毒，并且不需要細(xì)胞的存在，因此喉部拭子或唾液樣本可能是進(jìn)行分析的合適樣本[6]，但其檢出率低于83%[7]。相對(duì)無(wú)創(chuàng)而準(zhǔn)確率高的是鼻咽抽吸物標(biāo)本，能提供高濃度的感染細(xì)胞。對(duì)于兒童，采集一個(gè)口咽拭子和一個(gè)鼻部拭子的準(zhǔn)確性相當(dāng)于鼻咽拭子的準(zhǔn)確性[8]，是檢測(cè)準(zhǔn)確性與無(wú)創(chuàng)性采集的理想搭配。但臨床上為了避免假陰性，通常會(huì)同時(shí)采集一個(gè)口咽拭子和一個(gè)鼻咽拭子?？谘适米拥牟杉鄬?duì)比較簡(jiǎn)單，鼻咽拭子的采集需要經(jīng)過(guò)培訓(xùn)，而且鼻咽拭子的采集過(guò)程可能會(huì)引發(fā)患者打噴嚏或者咳嗽而導(dǎo)致氣溶膠的產(chǎn)生，存在交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)[9]。本文基于新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)作為乙類傳染病甲類管理辦法，介紹呼吸道標(biāo)本的采集、貯存和運(yùn)送[10,11]。

1 采集對(duì)象

SARS-CoV-2感染的COVID-19疑似病例、疑似聚集性病例，其他需要進(jìn)行SARS-CoV-2感染診斷或鑒別診斷病例，確診的COVID-19是否康復(fù)的鑒別病例，或其他需要進(jìn)一步SARS-CoV-2感染篩查檢測(cè)的環(huán)境或生物材料。

2 采集者

從事SARS-CoV-2檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)且為合格者和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。按照《兒童新型冠狀病毒感染/肺炎疑似和確診病例快速篩查和臨床實(shí)踐指南》[12]的要求使用三級(jí)防護(hù)，最好使用全面型電動(dòng)送風(fēng)呼吸器面罩進(jìn)行有效防護(hù)。

3 采集標(biāo)本

SARS-CoV-2初步診斷測(cè)試，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)建議收集和檢測(cè)咳嗽患兒的上呼吸道(鼻咽和口咽拭子)和下呼吸道(痰，如果可能)的樣本。按照國(guó)家衛(wèi)健委COVID-19診療方案(試行第六版)的要求，盡可能留取痰液標(biāo)本，氣管插管患者采集下呼吸道分泌物標(biāo)本。

4 采集標(biāo)本時(shí)機(jī)

臨床懷疑SARS-CoV-2感染應(yīng)立即向當(dāng)?shù)匦l(wèi)生部門報(bào)告，當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生工作人員將確定患者是否符合SARS-CoV-2感染調(diào)查對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)。臨床標(biāo)本應(yīng)在臨床或公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室采集，用于常規(guī)呼吸道病原體檢測(cè)。臨床實(shí)驗(yàn)室不應(yīng)從SARS-CoV-2感染者采集的樣本中分離病毒。一旦確定了符合SARS-CoV-2感染對(duì)象，應(yīng)盡快采集樣本。

5 采樣管及其保存液

上、下呼吸道標(biāo)本采集后均置于含3 mL病毒保存液的采樣管中，推薦以Eagle's基礎(chǔ)培養(yǎng)液為基礎(chǔ)的保存液。保存液中也應(yīng)添加胎牛血清或牛血清白蛋白等穩(wěn)定病毒的蛋白質(zhì)外殼的添加液。除此之外，還應(yīng)添加青霉素、鏈霉素、慶大霉素及多黏菌素B等抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，保存液提供的樣本基本是活病毒，可以最大程度保持樣本的原始性，后續(xù)不僅可以用于病毒的核酸提取檢測(cè)，還可用于病毒的培養(yǎng)和分離。

6 采樣拭子

應(yīng)選用合成纖維或人造纖維，不推薦海綿或棉花拭子，棉花的纖維對(duì)蛋白質(zhì)吸附較強(qiáng)，導(dǎo)致病毒不易洗脫到保存液中，也不推薦尼龍類的纖維，其吸水性不佳，導(dǎo)致采樣量不足，影響檢出效率。

7 樣本的儲(chǔ)存和拒收

原則上樣本應(yīng)立即送檢。以下是各種儲(chǔ)存必需的條件：①采集后，應(yīng)貼上相應(yīng)的標(biāo)簽，樣本可在4℃以下保存72 h，②如果預(yù)計(jì)提取檢驗(yàn)會(huì)延遲，則將樣本儲(chǔ)存在-70℃或更低的溫度，③提取的核酸應(yīng)儲(chǔ)存于-70℃或更低的溫度。

拒收的樣本包括：①?zèng)]有保存在2～8℃或-70℃或以下的樣本；②樣本標(biāo)簽或資料不完整；③樣本類型不合適；④樣本量不足。

8 樣本的運(yùn)送

①運(yùn)送人員防護(hù)要求：需對(duì)運(yùn)送人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，做好二級(jí)防護(hù)，目前中國(guó)的標(biāo)本運(yùn)送由CDC的專業(yè)人員來(lái)取，工作人員通道進(jìn)入，污染通道離開。②樣本需要雙層密封袋密封，每袋裝1份標(biāo)本，將樣本儲(chǔ)存在4℃，并使用密封的標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱(內(nèi)附有冰袋)立即運(yùn)送。在每個(gè)樣本容器上貼上患者的具體信息、樣本的具體信息。為每個(gè)提交的樣本填寫衛(wèi)生行政部門要求的表格。③如果樣本在-70℃下冷凍，運(yùn)輸時(shí)則將其放在密封的標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱(內(nèi)附有干冰)連夜運(yùn)送，如無(wú)-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存。

9 加強(qiáng)溝通

臨床和實(shí)驗(yàn)室工作人員之間的及時(shí)溝通很重要，這樣才能在處理可能SARS-CoV-2感染病例的標(biāo)本時(shí)將感染的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。

10 上呼吸道標(biāo)本采集

10.1 口咽拭子 ①視野要求：口咽拭子取樣時(shí)，應(yīng)該在良好的照明條件下，使用一次性壓舌板來(lái)確保咽喉部有足夠的視野，壓舌板將舌壓到一邊，避開舌頭，拭子擦拭扁桃體(圖1A、B)。②口咽拭子材質(zhì)的要求：只能使用帶塑料柄的合成纖維棉簽，不能使用海藻酸鈣拭子或帶木柄的拭子，因?yàn)樗鼈兛赡芎袦缁钅承┎《竞鸵种芇CR檢測(cè)的物質(zhì)。③患兒體位和口腔防護(hù)要求：患兒取坐位或臥位，采集者坐在患兒對(duì)面，以能夠看清患兒口咽部扁桃體為準(zhǔn)，采集的時(shí)候要讓患兒頭部上抬30度，采集時(shí)患兒應(yīng)該用口罩罩住鼻部，減少噴嚏或咳嗽飛沫飛濺(圖1C)。④取材要求：將口咽拭子深入口咽部，在原位最好保持10 s以吸收分泌物，用拭子棉簽同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，輕度用力拭抹咽后壁部位，應(yīng)避免觸及舌部。將口咽拭子棉簽頭浸入采樣管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

10.2 鼻咽拭子采集(圖1D、E) ①鼻咽拭子材質(zhì)要求同口咽拭子。②準(zhǔn)備含3 mL病毒保存液的采樣管備用。③患兒體位和口腔防護(hù)要求：患兒頭部后仰70度，采集時(shí)患兒應(yīng)該用口罩罩住下頜，減少咳嗽飛沫飛濺，取材人站在患兒側(cè)方，防止飛沫飛濺。④鼻咽拭子棒長(zhǎng)度要求：可以用鼻咽拭子棒測(cè)量一下，量出耳根到鼻孔的距離，并用手指做標(biāo)記。⑤體驗(yàn)要求：將采樣拭子以垂直鼻子(面部)方向插入鼻腔，與上顎平行，拭子伸入距離最少應(yīng)達(dá)耳垂部位到鼻尖長(zhǎng)度的一半，如果能夠達(dá)到先前估計(jì)的深度最好，可有阻擋感。⑥取材要求：深入鼻咽部，使拭子在鼻內(nèi)停留15～30 s，輕輕旋轉(zhuǎn)3～5次，以吸收分泌物，然后抽出拭子。⑦取材后要求：將鼻咽拭子棉簽頭浸入采樣管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

圖1上呼吸道標(biāo)本采集
注 A：扁桃體；B：鼻咽

11 下呼吸道標(biāo)本

11.1 支氣管灌洗液 將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管，見患兒有咳嗽反射后再稍微深入1 cm后，注入5 mL溫生理鹽水，開放負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的黏液于病毒采樣管中。

11.2 肺泡灌洗 該方法適合危重患兒，患兒往往因?yàn)楹粑ソ呋蚍尾粡埿枰袣夤懿骞芑蚶w維支氣管鏡灌洗，便于獲取肺泡灌洗液標(biāo)本，需要在支氣管鏡室局麻下行電子支氣管鏡術(shù)。支氣管鏡由左鼻孔進(jìn)入氣管、支氣管后，鏡端固定于右/左肺中葉開口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌溫生理鹽水，每次8 mL灌洗2～3次，灌洗后吸出[13]，收集至采樣管中。

11.3 鼻咽和氣管抽吸 嬰幼兒多需要采用該途徑采集標(biāo)本，使用痰液收集器連接負(fù)壓吸引器，痰液收集器前端的吸痰管深入到患兒氣道內(nèi)，見患兒有咳嗽反射后再稍微深入1 cm后開放負(fù)壓，吸出2～3 mL呼吸道分泌物至采樣管中。