賈 璇，王國(guó)勝

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

香蘭素，學(xué)名3-甲氧基,4-羥基苯甲醛，白色至淡黃色結(jié)晶粉末或針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)81～82 ℃，沸點(diǎn)285 ℃，是合成香料中全球生產(chǎn)量較大的，也作為中間體來(lái)合成藥物和其他香料.在乙醛酸法合成香蘭素過(guò)程中，由于反應(yīng)物與反應(yīng)條件的細(xì)小差異，會(huì)產(chǎn)生鄰位香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素等副產(chǎn)物[1].鄰位香蘭素作為香蘭素的同分異構(gòu)體，學(xué)名2-羥基,3-甲氧基苯甲醛，黃綠色針狀晶體或結(jié)晶狀粉末，熔點(diǎn)40～42 ℃，沸點(diǎn)265.5 ℃，是重要醫(yī)藥中間體，也是合成鹽酸黃連素的化工原料.鄰位香蘭素的合成主要來(lái)自于香蘭素的二次精餾，由于熔沸點(diǎn)等物化性質(zhì)接近，使其分離不徹底，因此其工業(yè)原料中還含有香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素等雜質(zhì).這印證了作為副產(chǎn)品的鄰位香蘭素，即使是市面上出售的所謂分析純藥品，其純度也僅有98 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)).

目前，尚無(wú)對(duì)鄰位香蘭素工業(yè)原料中鄰位香蘭素，以及所含雜質(zhì)甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素的官方檢測(cè)方法.文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[2-6]、毛細(xì)管電泳法[7-9]、紫外分光光度法[10-11]以及氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法-質(zhì)譜法[12-15].本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了鄰位香蘭素工業(yè)原料中鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素含量，方法簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，重現(xiàn)性好，以期為保證藥品質(zhì)量和人體健康提供技術(shù)支持.鄰位香蘭素、香蘭素、甲基香蘭素與乙基香蘭素的分子結(jié)構(gòu)如下：

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LCQ Deca XP Plus液相色譜質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Finnigan公司；鄰位香蘭素工業(yè)原料，東北制藥集團(tuán)有限公司；鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香蘭素對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0 %)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；醋酸銨(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；有機(jī)系微孔濾膜(孔徑0.45 μm)，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司.

1.2 樣品前處理

精密稱取20 g鄰位香蘭素工業(yè)原料置于100 mL燒杯中，加入20 mL分析純甲醇，攪拌至樣品全部溶解.于-4 ℃冰箱冷凝結(jié)晶，結(jié)晶完全后抽濾，濾渣干燥至質(zhì)量不再變化，室溫密封保存待用.

1.3 對(duì)照品與樣品溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精密稱取鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素對(duì)照品各25 mg，分別放于25 mL容量瓶?jī)?nèi)，用色譜專用乙腈溶解、稀釋至刻度，搖晃至均勻，得到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為0.99 g/L，于4 ℃冰箱保存.

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

① 精密量取甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置于容量瓶中，用乙腈-醋酸銨水溶液[V(乙腈)∶V(醋酸銨水溶液)=3∶7，c(醋酸銨水溶液)=0.02 mol/L]溶解、稀釋至刻度，搖晃至均勻，得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度分別為99、9.9、0.99、0.099 mg/L，于4 ℃冰箱保存，供高效液相色譜儀測(cè)定.

② 精密量取鄰位香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置于容量瓶中，用乙腈-醋酸銨水溶液[V(乙腈)∶V(醋酸銨水溶液)=3∶7，c(醋酸銨水溶液)=0.02 mol/L]溶解、稀釋至刻度，搖晃至均勻，得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，質(zhì)量濃度分別為495、99、49.5、9.9 mg/L，于4 ℃冰箱保存，供高效液相色譜儀測(cè)定.

1.3.3 樣品溶液的配制

稱取前處理過(guò)的4批次鄰位香蘭素工業(yè)原料各25 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用色譜專用乙腈溶解、稀釋至刻度，搖晃至均勻，得到相應(yīng)樣品溶液，質(zhì)量濃度為1 g/L，于4 ℃冰箱保存.之后精密量取樣品溶液適量，置于10 mL容量瓶中，用乙腈-醋酸銨水溶液[V(乙腈)∶V(醋酸銨水溶液)=3∶7，c(醋酸銨水溶液)=0.02 mol/L]稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.1 g/L的樣品溶液，于4 ℃冰箱保存.

1.4 色譜條件

色譜柱：Spherigel C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-醋酸銨水溶液[V(乙腈)∶V(醋酸銨水溶液)=3∶7，c(醋酸銨水溶液)=0.02 mol/L]；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器(UVD).

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素的特征吸收峰主要為229、278、308、279和309 nm.選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)條件下，各物質(zhì)的出峰檢測(cè)靈敏度均較高，并且分離效果良好.

2.2 流動(dòng)相的選擇

為使各組分基本分離、且達(dá)到預(yù)期效果，流動(dòng)相應(yīng)具備能改善待測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)、有效提高靈敏度的性質(zhì).組分在色譜柱上的吸附與有機(jī)改性劑的種類和比例有很大關(guān)系.實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇和乙腈對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明乙腈的洗脫能力更優(yōu)，故選擇乙腈.鄰位香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素中均含有酚羥基，顯酸性.在酸性化合物的色譜分離中，對(duì)于色譜峰的拖尾現(xiàn)象或化合物解離現(xiàn)象一般加入酸性添加劑來(lái)優(yōu)化，使保留增強(qiáng).又考慮到酸性添加劑的酸性過(guò)強(qiáng)會(huì)對(duì)色譜柱進(jìn)行損壞，故選醋酸銨溶液作為酸性添加劑.分別以乙腈-醋酸銨溶液(濃度為0.02 mol/L)體積比為2∶8、3∶7和4∶6作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-醋酸銨溶液(濃度為0.02 mol/L)體積比為3∶7時(shí)，鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素的保留時(shí)間分別為12.00、10.20、9.82和6.00 min，分離效果好，峰形對(duì)稱，響應(yīng)值高.

在上述優(yōu)化的色譜條件下，混合對(duì)照品和實(shí)際樣品的色譜圖如圖1所示，在15 min內(nèi)可以將鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素進(jìn)行分離.且可以看出實(shí)驗(yàn)選擇的色譜條件適用于這4種物質(zhì)的分離及分析.

圖1 混合對(duì)照品與實(shí)際樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and actual sample

2.3 方法的線性關(guān)系

分別配制不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在上述色譜條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行測(cè)定，得到4種化合物的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)及回歸方程，在3倍信噪比的進(jìn)樣濃度水平下計(jì)算出檢出限，結(jié)果如表1所示.

表1 鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and detection limits ofo-vanillin,methyl vanillin,ethyl vanillin and vanillin

2.4 方法的回收率與精密度

分別在鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素工作溶液中加入高、低2種質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6份，考察方法的加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2.結(jié)果表明此方法具有較高的檢測(cè)精密度及準(zhǔn)確度.

表2 鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素的加標(biāo)回收率及精密度Table 2 Recovery and precision of o-vanillin,methyl vanillin,ethyl vanillin and vanillin

2.5 實(shí)際樣品分析

精密稱取適量經(jīng)前處理過(guò)的鄰位香蘭素原料，用乙腈溶解，按照色譜條件測(cè)定其質(zhì)量濃度，共測(cè)定4批，結(jié)果見(jiàn)表3.結(jié)果表明本方法對(duì)于實(shí)際樣品中鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素的測(cè)定具有準(zhǔn)確性.

表3 鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素及 香蘭素的實(shí)際樣品分析Table 3 Contents of o-vanillin,methyl vanillin,ethyl vanillin and vanillin in real o-vanillin samples

3 結(jié) 論

建立了同時(shí)測(cè)定鄰位香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香蘭素含量的高效液相色譜法，通過(guò)對(duì)線性范圍、檢出限、回收率、精密度等的考察，確定該方法具有操作方便簡(jiǎn)單、測(cè)試高效、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能夠在實(shí)際樣品測(cè)定中得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果.該方法第一次建立了同時(shí)測(cè)定鄰位香蘭素工業(yè)原料中各物質(zhì)含量的高效液相色譜法，有利于優(yōu)化鄰位香蘭素的質(zhì)量監(jiān)控過(guò)程，為藥品的質(zhì)量和人體的健康提供技術(shù)支持.