徐蕾， 肖桂清， 盛曉菁， 戚智青*， 刁勇*

1. 華僑大學生物醫(yī)學學院，福建 泉州 362021；2. 福建省銀豐干細胞工程有限公司，福州 350004

當前由生物類因素(細菌、寄生蟲、病毒等)造成的各種人類、動植物嚴重流行病，例如埃博拉病毒[1]、寨卡病毒[2]、中東呼吸綜合征冠狀病毒[3]和新型冠狀病毒[4]，已引起各國政府及媒體的普遍關注，但目前尚缺少有效的病原體疫苗及治療措施，若不能對第一例疾病及時診斷，不僅會造成經(jīng)濟上的損失，更甚者直接威脅生命。對病原體的檢測，傳統(tǒng)的方法是通過體外培養(yǎng)病原體進行鏡檢，但該方法耗時長、操作繁瑣、誤差大,對操作人員要求也比較高,還存在一些難以培養(yǎng)的微生物檢測困難等問題[5]。而利用免疫學方法進行的酶標法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測病原體存在“窗口期”較長易造成漏檢、免疫靜默感染以及人工操作誤差等問題[6]，因此以聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)為代表的體外核酸檢測技術(nucleic acid test, NAT)因其簡單、快速、安全等優(yōu)點被廣泛應用于細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體、衣原體的快速檢測和鑒定以及疾病的早期篩查與診斷中[7]。

但目前在 PCR及PCR衍生技術的實際操作中，仍有一些難以克服的困難，如非特異性擴增、甚至假陰性結果，導致NAT的靈敏度、特異性和準確性差[8-9]，這時往往需要添加一些外部物質來提高NAT的靈敏度、特異性和準確性，而這類物質統(tǒng)稱為PCR增強劑(PCR enhancers)?，F(xiàn)在很多公司也相繼開發(fā)出相關PCR增強劑產(chǎn)品，如PCRx Enhancer System (Thermo Fisher Scientific)、 AmpFLSTRTMPCR Enhancer(Thermo Fisher Scientific)、MasterAmpTM10X PCR Enhancer(Epicentre)、PCR Enhancer(莊盟)。PCR增強劑作為一種核酸擴增優(yōu)化的方式越來越被人們所認可，這種新技術進一步推動了以PCR為基礎的各種檢測方法的廣泛應用，對于核酸檢測中的應用“瓶頸”得到了一定程度的解決，并提高了潛伏期的病原體檢測的檢出限。

1 以PCR為基礎的核酸檢測技術

PCR作為分子生物學領域最重要的技術，其允許在不同的DNA序列(例如總基因組DNA)中選擇性地擴增特定的目標DNA序列[10]。DNA分子的拷貝數(shù)在每一個擴展步驟中加倍最終產(chǎn)生數(shù)百萬拷貝，因此PCR技術最早被開發(fā)用于病原體的檢測和亞型鑒定，如今以PCR為基礎而衍生出來的各類PCR技術因高通量、核酸定量、快速等特點也漸漸成為核酸檢測的主流。

迄今為止，PCR衍生出的核酸檢測技術主要有實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)、巢式PCR、數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)。RT-PCR使用熒光染料將擴增和檢測結合起來，依賴于擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號定量分析[11]]。RT-PCR檢測方法已經(jīng)用于病原體的檢測，成功對利什曼原蟲[12]、B族鏈球菌(group BStreptococcus，GBS)[13]、基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)[14]等進行鑒定。RT-PCR相較于常規(guī)PCR交叉污染顯著降低，但RT-PCR最大的問題是標準曲線重復性差，定量范圍有限。巢式PCR又稱為多重PCR，實現(xiàn)了對未知病原體或多種病原體的一次快速檢測[15]。已有報道利用巢式PCR技術來對447個臨床樣品中細菌腦膜炎易染病原體檢測，約3 h就可得到臨床結果，而微生物培養(yǎng)法需3～7 d[16-17]。多重PCR技術價格低廉、靈敏度高、特異性強，可檢測少量DNA樣品，但多個引物間的配對、相互競爭等均會影響擴增效果，易出現(xiàn)非特異性擴增，需要對實驗進行嚴密的設計。近年來，數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)作為一種新興的核酸擴增檢測技術以優(yōu)異的檢測靈敏性、特異性和重現(xiàn)性在核酸檢測中越來越受到重視[18]，dPCR可敏感地檢測腦脊液和外周血單核細胞樣本中人體免疫缺陷病毒核酸[19-21]。dPCR不存在RT-PCR的標準曲線對結果有影響等問題[22]，但因其價格較高尚未廣泛應用，在檢測低拷貝基因時，dPCR的靈敏性低也成為核酸檢測的限制。

目前，常規(guī)PCR已經(jīng)成為最普及使用的核酸檢測方法；在單基因檢測上RT-PCR也得到應用；dPCR也是目前最靈敏、最高通量的檢測方案，實現(xiàn)了同時對多位點基因檢測篩選；同時開發(fā)出各種新型核酸檢測技術如滾環(huán)擴增(rolling-circle amplification，RCA)、基因芯片以滿足更加靈敏、特異、快速、高通量、低成本的檢測需求。

2 核酸檢測技術存在的問題

在核酸檢測的應用中，利用PCR及其衍生技術直接診斷需要高水平的敏感性和特異性，檢測的實際情況往往達不到要求，經(jīng)常出現(xiàn)如下狀況。①靈敏度低。對于早期疫病的診斷，這時標本中病原體的核酸量是極少的，PCR可檢測pg級別的核酸，但有時DNA含量可能極低且不足以進行PCR，造成了檢測的敏感度較低。②特異性差。檢測中的實驗結果經(jīng)常出現(xiàn)多個非特異性條帶、條帶彌散、假陽性或假陰性結果，這時特異性差可能是由模板造成的。一方面，用于PCR的DNA樣本往往不是DNA擴增的最佳來源，樣本中存在PCR抑制劑[23-24]，而純化過程可能導致目標DNA的丟失，費時費力，增加成本，涉及到多個樣本的操作還會增加交叉污染的風險；另一方面，DNA的模板也常含有GC含量高的序列[25]，退火時單鏈 DNA 容易形成局部二級結構或發(fā)夾結構[26]，并可能導致DNA聚合酶擴增提前停止，或者模板序列高度重復序列、同源重組序列，這些情況都會造成DNA擴增失敗，嚴重影響核酸的特異性正確檢測。③保真度低。PCR的保真度往往與DNA聚合酶有關，最常用的TaqDNA聚合酶的錯誤率為(2.7×10-4)±(0.8×10-4)，現(xiàn)在市面上出現(xiàn)了價格昂貴的高保真PhuDNA聚合酶、KodDNA聚合酶使得保真度進一步提高，但在擴增長的片段(>10 kb)時，錯配率升高，持續(xù)合成能力降低。在基于PCR的病原體診斷中，這些缺陷會成為障礙，需要對PCR技術優(yōu)化，而PCR增強劑是一種有可能繞過這些限制的優(yōu)化方法。

3 PCR增強劑在以PCR為基礎核酸檢測中的研究及應用

PCR增強劑是可以改善PCR及PCR衍生技術的靈敏度、特異性、保真度等的一類添加劑，可以顯著改善假陽性、假陰性或無法擴增等情況，使準確度提高，檢測的最低檢出限提高，甚至當調整循環(huán)數(shù)、鎂離子、引物、dNTP、DNA聚合酶和DNA模板濃度等優(yōu)化方案無法解決問題時，能夠提出一種更有效的策略，這種策略突破了原有檢測技術的缺陷，對于病原體正確、快速的診斷具有重要意義。目前關于PCR增強劑存在很多類型，不同類型的PCR增強劑也針對不同核酸擴增問題提出了一定的解決方案。

3.1 小分子化學類PCR增強劑

小分子化學類PCR增強劑是最早出現(xiàn)的增強劑，其中二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)[27]和n，n，n-三甲基甘氨酸(又稱甜菜堿)[28]是最常用的增強劑。DMSO經(jīng)常作為PCR標準擴增優(yōu)化的一部分；甜菜堿作為滲透保護劑，與甘油的功能類似，可以防止DNA聚合酶變性，QIAGEN和Clontech公司PCR增強劑產(chǎn)品也被證明含有甜菜堿[29]。如今也發(fā)現(xiàn)了更多化學物質有此作用，在PCR擴增中加入多種增強劑來提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率、特異性和一致性，這其中包括甲酰胺、甘油、四甲基氯化銨等[30]，這些添加劑都對PCR及相關PCR技術擴增產(chǎn)生了有益的影響，而復合型PCR增強劑是將多種PCR增強劑按一定比例混合而成的一種新型PCR增強劑，對PCR的促進效率更高。如利用甘油、甲酰胺、DMSO和甜菜堿的PCR增強劑組合對含高GC的偽狂犬病毒進行PCR，使得之前無法擴增的PCR可以擴增，并且錯配率有了明顯的降低[31]。Horkov等[32]在含有PCR抑制物(如肝素、血紅蛋白)的全血中擴增基因片段，通過不同增強劑組合發(fā)現(xiàn)1，2-丙二醇和海藻糖組合可以強而特異地進行RT-PCR。其中，海藻糖可通過保護酶免受血液抑制劑的干擾而起作用；1，2-丙二醇可以降低dsDNA片段的退火溫度擴增富含GC的模板，為粗血樣中富含GC核酸的RT-PCR提供了一種通用增強劑，并且在不同熒光探針中也可以使用。

小分子化學PCR增強劑在商業(yè)上容易獲得且價格低廉，商業(yè)化PCR增強劑也多是以小分子化學物質作為主要成分，這些添加劑雖然可以提高PCR反應的產(chǎn)率、特異性、保真度，但它們對DNA解鏈溫度的影響改變了特定引物模板體系的最佳退火溫度，因此可能需要對熱循環(huán)參數(shù)進行優(yōu)化。同時，因不能預測哪種試劑可能對特定的目標有用，所以需要測試幾種不同的添加劑。

3.2 納米材料類PCR增強劑

隨著納米技術的出現(xiàn)，納米材料由于其大的表面積和體積比、表面電荷密度和良好的熱導率等優(yōu)異的物理化學特性以及與單鏈DNA或蛋白質結合的特點常用來輔助PCR，這種方法被稱為納米-聚合酶鏈式反應(nano-PCR)。迄今為止，各種納米系統(tǒng)已被報道用于增強PCR反應[33-37]，例如金納米顆粒(gold nanoparticles，AuNPs)、氧化石墨烯(graphene oxide，GO)、量子點(quantum dots,QDs)、上轉換納米粒子(upconversion nanoparticles，UCNPs)、碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)以及其他金屬納米粒子和納米復合材料。2005年上海交通大學學者首次利用AuNPs改善了易出錯的兩輪PCR，并抑制了多重PCR的非特異性擴增，與化學類PCR增強劑不同，添加AuNPs即使在非最佳退火溫度下也能獲得一個單一的產(chǎn)物帶[38]。目前，基于AgNPS建立了一種檢測和鑒別野生型和基因缺失型偽狂犬病毒的分析方法，檢測靈敏度比常規(guī)PCR提高了100～1 000 倍[39]。AgNPS也第一次被應用于豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的快速臨床檢測，最低檢出限為2.7×10-6ng·μL-1PEDV[40]。Cui[41]首次報道了CNTs在PCR中的促進作用，即使在不含Mg2+參與的PCR反應情況下也獲得了相似結果。

納米材料不僅可以作為PCR的添加劑，同樣也是新型PCR技術的主要載體，納米材料可應用于PCR可視化檢測、芯片檢測、生物傳感器。Wang等[42]篩選出2種材料MoS2、WS2以增強SYBR GreenⅠ探針的RT-PCR反應信號，結果表明視覺檢測的靈敏度可與實時檢測結果媲美，同時MoS2、WS2還能抑制非特異性擴增。在基因芯片檢測方面，加入Fe3O4納米粒子可使PCR產(chǎn)率提高190%[43]，利用Fe3O4磁性還可快速去除納米材料。

納米材料作為一種生物相容性良好的材料，即使在較低的退火溫度下，也能提高PCR擴增的特異性和靈敏性，而化學類PCR增強劑往往需要調整Tm值。納米材料的優(yōu)良導熱性是PCR優(yōu)化的基礎，可以快速地提高或降低反應溫度，縮短反應時間，以實現(xiàn)病原體的更快速診斷，對疾病控制具有重要意義。但目前在市場上并沒有納米材料PCR增強劑相關商品開發(fā)，納米材料復合添加劑的研究也鮮有報道，已有報道稱使用TiO2NPs-AgNPs用于空氣中細菌氣溶膠的檢測，擴增效果明顯優(yōu)于單一納米類PCR增強劑[44]，未來可針對復合型的納米PCR增強劑的研制進一步研究。

納米材料濃度和大小對PCR及衍生技術的擴增也有影響，低濃度的納米粒子抑制長片段的擴增，高濃度的納米粒子抑制小片段的擴增，因此在使用時要控制濃度范圍。納米材料輔助PCR的另一個問題是如何將納米材料從PCR中分離出來，如低于20 nm AgNPs分離需要相當大的離心力，且長時間才使其沉淀，凝膠純化法是從溶液中去除納米材料的一種選擇，但對于多個克隆或測序的下游應用來說不是有效的方案。未來的納米材料可采用涂層或集成PCR管，而不是將納米材料與試劑混合，這種方法可以解決PCR產(chǎn)物與納米材料分離的問題。因此，納米材料作為一種廉價、高穩(wěn)定性的物質，在未來的PCR及其衍生技術上有很大的應用潛力。

3.3 蛋白質類PCR增強劑

在體內的核酸擴增過程中，單鏈結合蛋白(single-stranded DNA-binding proteins，SSBs)以非特異性的方式與單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)結合，保護瞬時形成的ssDNA免受核酸酶的攻擊，并防止二級結構的形成，在DNA復制、重組和修復過程中起重要作用。關于體外核酸擴增的生物類PCR增強劑的研究中，人們也將目光轉向了SSBs，與體內SSBs不同之處在于用于為核酸檢測的SSBs必須具有耐熱性質，2003年Perales等[45]從一嗜熱桿菌中分離純化出耐熱的TthSSB，在PCR過程中添加TthSSB，提高了DNA擴增的效率和保真度，并使延伸時間縮短。隨后2009年Mikawa等[46]發(fā)現(xiàn)使用TthSSB可使RCA中的非特異性DNA產(chǎn)物消除。在蛋白質類PCR增強劑研究中，T4 基因的32蛋白(GP32)也是一種單鏈DNA結合蛋白[47]，在促進PCR方面有一定的作用。本實驗室也在DNA結合蛋白的基礎上第一次發(fā)現(xiàn)了雙鏈DNA結合蛋白組蛋白樣蛋白(HU)也具有PCR、RCA增強作用，HU不僅像SSB、GP32結合ssDNA，對dsDNA也有結合，這就意味著HU在PCR中有著不同的作用機制，同時實驗證明HU還能抑制非特異性片段的擴增，在實際應用中發(fā)現(xiàn)它比SSB有更優(yōu)異的促進作用[48]。

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)也是常用的PCR增強劑[49]，具有較高的賴氨酸含量，可與酚類化合物和多糖結合，避免聚合酶失活。在血液、糞便和肉的核酸檢測中PCR抑制劑的存在常使DNA聚合酶失活，BSA的存在降低了抑制物的抑制作用，且老化和降解樣品DNA含量較低，BSA提高了PCR敏感性。在急性氣性咽炎的診斷中，添加12 mg·mL-1BSA、40 mg·mL-1PEG 400、0.5% Tween 20為RT-PCR開發(fā)了一種更經(jīng)濟、準確的檢測方法[50]。在防止引物二聚體形成方面，牛凝血酶(bovine thrombin，BT)具有獨特的效果，通過對人基因組DNA和乙型肝炎病毒基因組DNA的檢測，證實了BT的PCR增強作用。此外，BT還能夠有效減輕高濃度的納米材料(例如AuNPs和GO)所引起的PCR抑制作用，與最受歡迎的PCR增強劑BSA相比，要達到相同的PCR增強水平BT比BSA所需的濃度低18～178倍[51]。

在復雜的樣品中，蛋白質類PCR增強劑常作為一種DNA聚合酶保護劑，不影響PCR的退火溫度，在以PCR為基礎的核酸檢測中可能通過模仿體內的復制過程提高靈敏度、特異性，與其他類型的PCR增強劑聯(lián)合使用，更在一定程度上改善其他增強劑引起的高濃度抑制的現(xiàn)象，但蛋白質類PCR增強劑添加過多也會產(chǎn)生抑制。蛋白質類PCR增強劑的生產(chǎn)制備成本高且不宜于保藏，僅BSA因價格低廉成為目前最常用的蛋白質類PCR增強劑。由于復雜的PCR擴增過程，蛋白質類PCR增強劑促進的機理也尚在研究中。

3.4 其他類PCR增強劑

除了小分子化學、納米、蛋白質類PCR增強劑，其他類型如元素混合物、核酸類化合物7-去氮-dGTP(7-deaza-dGTP)[52]、高聚物聚乙二醇等在核酸檢測中也具有PCR促進作用。將固體元素混合物金、鈦、鎳、鉍、銻加入多重PCR，可提高PCR的特異性、產(chǎn)率，縮短反應時間。此外，7-去氮-dGTP是一種dGTP類似物[53]，在低GC含量(5%～15%)和高GC含量(81%～90%)的模板中明顯提高擴增，克服了其他類型的PCR增強劑在高AT模板難于檢測的困難。最近，dPCR中添加7-去氮-dGTP有效檢測了皮膚黑色素瘤的端粒酶逆轉錄酶啟動子(GC>80%)[54]，而使用DMSO作為增強劑無PCR產(chǎn)物。這些增強劑在檢測中并不常用，但它們具有特殊的性質，往往可以解決其他增強劑無法克服的困難。

4 PCR增強劑的優(yōu)化機理

目前關于PCR增強劑的優(yōu)化機理并沒有確切的說法，但根據(jù)PCR增強劑的性質提出以下可能機制：①能以某種方式模擬體內SSBs的功能，與ssDNA結合，從而使引物與模板之間的錯配最小化；②能夠與DNA模板或DNA聚合酶發(fā)生強烈的相互作用或結合，從而顯著提高聚合酶或DNA模板的局部濃度，大大提高PCR的特異性和效率；③提高模板與引物之間的特異性結合，降低非特異性或涂片產(chǎn)物形成的機率。不同物質的PCR增強劑因性質不同，這3種機制可能同時起作用，也可能單獨起作用。此外，一些物質還具有特殊的性質，如納米材料具有良好的熱導性可以降低退火溫度，蛋白質類PCR增強劑HU因本身可以與dsDNA結合，在PCR擴增過程中的機理更為復雜。關于PCR增強劑的作用機理可通過高分辨率透射電鏡、毛細管電泳-激光誘導熒光偏振等技術進一步研究，為實際應用提供理論基礎。

5 展望

2019年12月爆發(fā)的新型冠狀病毒公共健康危機激起了人們對流行病檢測的關注，而近年來的病原體檢測中，依靠PCR增強劑使核酸檢測更加敏感、準確、快速地進行診斷，在傳染病防控、遺傳病診斷、農(nóng)業(yè)轉基因作物鑒定、法醫(yī)學分析等領域中建立了一種新型、適用性廣、快速的檢測系統(tǒng)，在大片段基因合成中PCR增強劑也可起到優(yōu)化作用。目前，市售PCR增強劑價格昂貴、具有未知的成分及難以調節(jié)單個組分的濃度[55]，同時對PCR體系所使用的酶也有所限制，使得產(chǎn)品在基礎檢驗領域并未廣泛適用。本文對目前最常用、最新的PCR增強劑進行了總結，對一些病原體核酸檢測的缺陷也提出了解決策略，未來可針對高爆發(fā)的流行病利用一種或幾種PCR增強劑研制PCR及相關衍生技術試劑盒，這對流行病大爆發(fā)時核酸的快速、準確檢測具有重要意義。

如今也發(fā)現(xiàn)納米材料不僅作為PCR增強劑發(fā)揮作用，納米材料也是可視化、基因芯片檢測、生物傳感器等PCR新型技術的重要載體，在未來核酸檢測領域有望開發(fā)出集特異性、敏感性、準確性為一體的新型檢測技術。化學類、納米類、蛋白質類及其他類PCR增強劑在核酸檢測中都可提高檢測靈敏性、特異性、產(chǎn)率，但PCR增強劑的使用也存在缺點，PCR增強劑的濃度和添加量需要在一定的范圍內才起到有益的促進作用，添加超出或少于此范圍時會起到抑制作用，同時由于每個樣本的模板、實驗儀器、場所等情況不同，因此在不同的核酸檢測中只能通過大量實驗或已有研究添加，不能預測實際情況，所以未來還需開發(fā)更加穩(wěn)定、廉價、應用范圍廣的PCR增強劑以克服核酸檢測缺陷的新型核酸檢測技術。