邱冠宇， 李維杰， 劉寶林

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存技術(shù)之一。使用這種技術(shù)可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而保存細(xì)胞特性，這樣在需要的時候可隨時復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。同時適度地保存一定量細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟失，起到了細(xì)胞保種的作用。細(xì)胞的低溫保存有2種方法:慢速冷卻法與玻璃化保存法[1]，這2種方法都需要添加低溫保護(hù)劑[2]。二甲基亞砜(Me2SO，DMSO)是一種重要的滲透型細(xì)胞保護(hù)劑。在超低溫保存細(xì)胞時使用DMSO冷凍保護(hù)劑，可以有效地防止細(xì)胞內(nèi)液生成冰晶、滲透壓改變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的損傷。DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，通過降低胞內(nèi)水的冰點(diǎn)來延緩細(xì)胞的凍存過程。同時也能通過提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度, 來降低細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成數(shù)量，從而減少細(xì)胞損傷。DMSO是目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞保護(hù)劑之一[3-13]。

目前在細(xì)胞的冷凍保存方面，最常用的DMSO濃度為10%，能夠起到有效的保護(hù)作用，但有研究表明 DMSO 存在嚴(yán)重的毒副作用，它可與細(xì)胞內(nèi)的蛋白巰基基團(tuán)發(fā)生作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，對肝細(xì)胞膜造成損害[14-15]。有文獻(xiàn)表明, 當(dāng)DMSO≥0.8%時，隨著濃度的增加以及作用時間的延長，DMSO對RPMI8226 細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度-時間依賴性關(guān)系(P<0.05)，且在熒光顯微鏡下可觀察到凋亡細(xì)胞[16]。因此，在肝細(xì)胞低溫冷凍保存的過程中，應(yīng)盡量降低DMSO的濃度，以達(dá)到減少DMSO毒性對肝細(xì)胞損害的目的。

原發(fā)性肝癌已經(jīng)成為全球常見惡性腫瘤，肝細(xì)胞癌(hepatocellulareareinoma, HCC)是原發(fā)性肝臟惡性腫瘤中的最主要類型，在我國的發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第4位，死亡率居第3位[17-18]。因此對肝細(xì)胞研究具有重要的意義。本研究以肝細(xì)胞作為保存對象，以響應(yīng)面法設(shè)計不同濃度的DMSO、甘油、海藻糖制成的混合冷凍保護(hù)劑對肝細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存來探究最佳的配比，以期降低DMSO的濃度，同時進(jìn)一步提高細(xì)胞的存活率。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：人肝細(xì)胞(購于上海生物細(xì)胞研究所)。

實(shí)驗(yàn)試劑：二甲基亞砜(Me2SO，德國APPLICHEM公司)；海藻糖、甘油(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBCO公司);臺盼藍(lán)染色液(碧云天生物技術(shù)公司);胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1保護(hù)劑配置 按表1所示進(jìn)行復(fù)合保護(hù)劑的配置。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計因素及水平Table 1 Design factor and horizontal coding of response surface methodology

1.2.2肝細(xì)胞處理 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，吹打后將細(xì)胞移至15 mL離心管中(1 000 r·min-1，4 min)。離心結(jié)束后吸棄胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻。將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1.0～1.5 mL。

1.2.3肝細(xì)胞凍存 將裝有細(xì)胞的凍存管放入-4 ℃冰箱2 h，然后放入-80 ℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)放置24 h。

1.2.4細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37 ℃溫水中震蕩約2 min。從37 ℃水浴中取出凍存管，將吸出細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中離心(1 000 r·min-1，4 min)。

1.2.5細(xì)胞存活率的計算 取制成的細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)染色的方法[19]測定肝細(xì)胞存活率。具體方法是：取細(xì)胞液和臺盼藍(lán)染色劑，以4∶1的比例在小試管中混勻，靜置3 min，取適量用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，分別計數(shù)活細(xì)胞與死細(xì)胞數(shù)量來確定細(xì)胞存活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以確定最佳保護(hù)劑配比。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化冷凍保護(hù)劑配比

根據(jù)表1 選定的響應(yīng)面考察因素和水平，通過Box-Behnken方法設(shè)計得到 17 組試驗(yàn)，具體方案及結(jié)果見表2。細(xì)胞復(fù)溫存活率為56.74%～84.35%不等，基本符合預(yù)期，證明3種保護(hù)劑配比設(shè)計是合適的。其中8組存活率較高，10組存活率較低。

2.2 模型建立與方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到肝細(xì)胞存活率(Y)與各因素之間的二次多元回歸擬合方程為：

Y=+80.25+2.78 A-0.66B+8.28C+3.24AB+4.33AC+0.50BC-4.92A2-8.70B2-5.18C2

由表3得知，該二次多項(xiàng)模型顯著，Adeq Precision(精密度)=30.197>4，表明該模型是可用的，足以擬合出試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方法較可靠，決定系數(shù)R2=0.992 0，說明該回歸方差模型擬合度較好。在該方差分析中，F(xiàn)值體現(xiàn)各單因素對肝細(xì)胞存活率影響的大小，F(xiàn)值越大，提取效果越好，從表中可以看出C>A>B，即對肝細(xì)胞存活率的影響因素中，海藻糖的影響最大，其次是DMSO，影響最小的是甘油。

表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface methodology

2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面法有著正交試驗(yàn)所不具備的特點(diǎn)，它可以給出直觀的圖形，考察2個因素之間的交互作用對肝細(xì)胞存活率的影響[20]。等高線圖為鞍馬或橢圓形時，表示兩者交互作用較顯著。另外，響應(yīng)面圖中曲面的陡峭程度能直接反映單因素對該響應(yīng)值存活率影響的大小。

如圖1所示，交互作用DMSO和甘油濃度的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)曲面圖可以看出，在A(DMSO濃度)為4%的水平和B(甘油濃度)為6%的水平上，提取效果最好。

如圖2所示，交互作用DMSO和海藻糖濃度的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)曲面圖可以看出，在A(DMSO濃度)為4%的水平和C(海藻糖濃度)為0.2%的水平上，提取效果最好。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析 Table 3 Variance analysis of quadratic respoase surface regression model

注：**表示差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。

如圖3所示，甘油和海藻糖濃度的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)曲面圖可以看出，在B(甘油濃度)為6%的水平和C(海藻糖濃度)為0.2%的水平上，提取效果最好。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)，最終優(yōu)化出的保護(hù)劑配方參數(shù)為：DMSO濃度3%，甘油濃度6%，海藻糖濃度0.1%。該配比下肝細(xì)胞存活率的預(yù)測值為84.35%。并在該配比條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到的存活率為81.36%。結(jié)果表明，響應(yīng)面可行性良好，優(yōu)化出的工藝條件有效。

圖1 DMSO和甘油濃度對肝細(xì)胞復(fù)活率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots of DMSO and glycerol concentrations on hepatocyte reactivation rate

圖2 DMSO和海藻糖濃度對肝細(xì)胞復(fù)活率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots of DMSO and trehalose concentrations on hepatocyte reactivation rate

圖3 甘油和海藻糖濃度對肝細(xì)胞復(fù)活率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of glycerol and trehalose concentrations on hepatocyte reactivation rate

3 討論

本試驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化冷凍保護(hù)劑中3種試劑濃度的配比，以肝細(xì)胞復(fù)溫存活率為響應(yīng)值進(jìn)行了分析。結(jié)果表明3種因素對復(fù)溫肝細(xì)胞存活率依次為海藻糖、DMSO、甘油。且得出的最佳工藝參數(shù)為DMSO濃度3%，甘油濃度6%，海藻糖濃度0.1%。在此條件下3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出的值與預(yù)測值較為接近，方法較可靠。由此可見，該工藝條件有效地降低了DMSO的濃度，減少了由此帶來的對肝細(xì)胞造成的毒性損害，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)胞外DMSO的合適濃度，但由于DMSO是一種滲透性保護(hù)劑，至于凍存之后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了多少DMSO的殘留，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定；其次，有關(guān)于海藻糖的濃度是否還有細(xì)化的空間也需進(jìn)一步探究。在之前實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，大于0.3%濃度的海藻糖會由于保護(hù)液的滲透壓太大，從而在凍存前使肝細(xì)胞全部死亡，因此對海藻糖的濃度有待更深層次的研究。最后，希望通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，能夠提示在其他類別的細(xì)胞凍存中也降低DMSO毒性的危害，同時積極去尋找新型的無毒保護(hù)劑，來逐步替代毒性保護(hù)劑。