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水相中氫氣濃度檢測(cè)方法的建立

2020-04-06 07:59:36張昭魏婭楠儀楊馬勝男張曉康馬雪梅張?chǎng)?/span>
生物技術(shù)進(jìn)展 2020年2期
關(guān)鍵詞:精確度水相低濃度

張昭, 魏婭楠, 儀楊, 馬勝男, 張曉康, 馬雪梅, 張?chǎng)?/p>

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124

氫氣(H2)無色無味,是自然界最小的分子,同時(shí)也是宇宙中含量最多的元素。過去H2被認(rèn)為是生物惰性氣體。近年來,隨著對(duì)其生物學(xué)功能的深入研究,研究人員認(rèn)為H2可能是繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氫(H2S)之后又一個(gè)重要的氣體信號(hào)分子[1]。2007年Ohsawa等[2]發(fā)現(xiàn)氫氣可顯著改善腦缺血再灌注損傷,由此引起了對(duì)于氫氣的研究熱潮。研究表明,H2對(duì)多種人類疾病和病理狀態(tài)都具有明顯的緩解和治療效果,如氫分子在抗氧化、抗炎癥等方面都發(fā)揮著重要作用[3-6]。此外,H2在植物學(xué)上也具有重要的生理作用,其不僅可提高植物對(duì)生物/非生物脅迫的抗性,還參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[7-9]。

目前飲用富氫水(hydrogen-rich water,HRW)是常用的攝取氫的方式[10-18],水相中氫氣濃度的準(zhǔn)確測(cè)定是各項(xiàng)研究以及后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。目前,測(cè)定溶液中氫氣濃度的方法主要有電極法、氣相色譜法和氧化還原滴定法[19]。電極法是通過測(cè)定溶液中氧化還原電位的變化而確定溶液中氫氣的濃度;氣相色譜法主要依據(jù)樣品成分與色譜柱沸點(diǎn)、極性或吸附性的不同,氣體通過色譜柱時(shí)被分離,各種物質(zhì)到達(dá)檢測(cè)器時(shí)間有所不同,從而可以對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定性和定量測(cè)定;氧化還原滴定法是利用亞甲基藍(lán)在膠體鉑催化下與氫氣發(fā)生氧化還原反應(yīng)使亞甲基藍(lán)褪色,通過亞甲基藍(lán)的用量計(jì)算出溶液中氫氣的含量[19],但此方法誤差較大,且準(zhǔn)確度不高?;诖耍狙芯刻骄糠謩e利用氫氣微電極和頂空氣相色譜檢測(cè)小體系溶液中氫氣濃度的可行性,并對(duì)這2種方法進(jìn)行比較,以期建立一種可廣泛用于氫氣生物學(xué)研究和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的氫氣濃度檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)氮?dú)?、氧氣購自北京誠為信氣體有限公司。Milli-Q Advantage A10純水設(shè)備購自美國Millipore公司;ZK-300純水氫氣發(fā)生器購自北京中科匯恒技術(shù)開發(fā)有限公司;氫氣微電極購自丹麥Unisense公司;GCMS-QP2010 Ultra氣質(zhì)聯(lián)用儀購自日本島津公司,配備同公司的介質(zhì)阻擋放電氦等離子體檢測(cè)器(dielectric barrier discharge ionization detector,BID)、SH-RtTM-Msieve 5A色譜柱;氣相色譜瓶購自美國安捷倫科技有限公司。

1.2 飽和HRW的制備

將純水氫氣發(fā)生器制得的氫氣(99.999%)通入100 mL超純水(ddH2O)中以制備HRW,每隔10 min使用氫氣微電極測(cè)定一次,直至飽和,氫氣在20 ℃下溶解度為1.62 mg·L-1[20]。制得飽和HRW后,立即使用ddH2O稀釋,配制成不同濃度的HRW(表1)以用于測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線,溶液總體系為500.0 μL。

表1 高濃度和低濃度HRW配制Table 1 Preparation of high concentration and low concentration HRW

1.3 電極法測(cè)定HRW中氫氣濃度

1.3.1電極極化 將氫氣微電極浸泡于ddH2O中,電極極化電壓設(shè)置為1 000 mV,隨后逐漸下降,并最終穩(wěn)定在某一數(shù)值,待此數(shù)值穩(wěn)定10 min以上后,電極極化結(jié)束,可以開始樣品檢測(cè)。電極極化時(shí)間一般需要1~2 h。

1.3.2樣品檢測(cè) 將500 μL不同濃度的HRW置于1.5 mL離心管中,將電極插入液面以下,待信號(hào)值穩(wěn)定后,記錄數(shù)據(jù)。

1.4 氣相色譜法測(cè)定HRW中氫氣濃度

1.4.1氣相色譜參數(shù)設(shè)定 采用恒線速度控制方法,恒線速度60 cm·s-1,使用SH-RtTM-Msieve 5A色譜柱,柱溫50 ℃,進(jìn)樣口溫度為250 ℃,分流比為5∶1,壓力為200.2 kPa,柱流量為3.85 mL·min-1,檢測(cè)器為BID。

1.4.2可行性鑒定 為了鑒定利用氣相色譜法測(cè)定水相中氫氣濃度的可行性,利用99.999%的標(biāo)準(zhǔn)氫氣、氮?dú)?、氧氣?.9 mL氣相色譜瓶中配制混合氣體。按照1.4.1進(jìn)行參數(shù)設(shè)定,對(duì)混合氣體樣品進(jìn)行分離測(cè)定。

1.4.3平衡時(shí)間對(duì)于氣相色譜法測(cè)定結(jié)果的影響 平衡時(shí)間是指在一定條件下達(dá)到Henry平衡所需要的時(shí)間。由Henry平衡定律可知,在密閉空間中,當(dāng)密閉空間中氣液體積比大于2時(shí)可近似認(rèn)為液相中的氣體全部轉(zhuǎn)化到氣相中[21]。因而,按照1.4.1進(jìn)行參數(shù)設(shè)定,測(cè)定在37 ℃、500 r·min-1的條件下[20]達(dá)到Henry平衡所需要的時(shí)間。

1.4.4樣品檢測(cè) 將不同濃度的HRW置于1.9 mL氣相色譜瓶中,溶液總體系為500 μL。達(dá)到Henry平衡后[20-21],采用頂空法手動(dòng)進(jìn)樣1 mL。

1.5 方法檢出限及精確度分析

1.5.1電極檢出限的確定 取少量HRW,使1.5 mL離心管中HRW的濃度為預(yù)期方法檢出限(method detection limit,MDL)的1~5倍,按照1.3進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)劉麗君等[11]的MDL測(cè)定方法,MDL的計(jì)算公式如下:

MDL=S×t(n-1,1-a=0. 99)

式中:n—重復(fù)測(cè)定樣品數(shù);S—n次測(cè)定濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差;t—自由度為n-1時(shí)的 Student值;1-a—置信水平。

1.5.2氣相檢出限的確定 取少量HRW,使HRW的氫氣濃度為預(yù)期MDL的1~5倍,達(dá)到Henry平衡后,按照1.4進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算方法同1.5.1。

1.5.3精確度計(jì)算 對(duì)于某一濃度樣品(在高、低濃度范圍內(nèi)隨機(jī)配制)平行測(cè)定9次,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飽和HRW的制備

向100 mL ddH2O中通入氫氣(99.999%),水相中氫氣的濃度隨著通氫氣時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,如圖1所示,在常溫常壓條件下,通氫氣20 min即可制得飽和HRW。

圖1 飽和HRW的制備Fig.1 Preparation of saturated HRW

2.2 電極法測(cè)定水相中氫氣濃度

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用氫氣微電極分別測(cè)定高濃度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低濃度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氫氣的濃度。以水相中氫氣濃度為縱坐標(biāo),以氫電極的信號(hào)值為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2A所示,高濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 402x-0.028 35,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 8;如圖2B所示,低濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 580x-0.030 28,R2=0.999 7。因此,低濃度、高濃度HRW中,水相中氫氣濃度與氫氣微電極信號(hào)值之間均具有良好的線性關(guān)系。

圖2 氫電極法檢測(cè)水相中氫氣濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of detecting hydrogen concentration in HRW by hydrogen microsensor

2.2.2精確度分析及檢出限分析 利用氫氣微電極對(duì)某一高濃度(0.72 mg·L-1)、低濃度(0.012 mg·L-1)樣品進(jìn)行9次平行測(cè)定,對(duì)該測(cè)定方法進(jìn)行精確度分析,由表2可知在0~1.620 0 mg·L-1范圍內(nèi),該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 9 mg·L-1,變異系數(shù)為1.775 3%。結(jié)果表明該方法精確度較高,滿足水相中高濃度氫氣的測(cè)定要求。

表2 電極法檢測(cè)高濃度和低濃度HRW的精確度分析Table 2 Accuracy analysis of high concentration and low concentration HRW detection by hydrogen microsensor

由表2可知,在0~0.202 5 mg·L-1范圍內(nèi),用電極法測(cè)定低濃度HRW的樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 3 mg·L-1,變異系數(shù)為11.734 0%。根據(jù)1.5中的公式,t(8,1-a=0. 99)=3.355 0,MDL=S×t(8,1-a=0.99)=0.004 4 mg·L-1。表明該方法精確度較高,滿足水相中低濃度氫氣的測(cè)定要求。

2.3 氣相色譜法測(cè)定水相中氫氣濃度

2.3.1方法可行性鑒定 采用頂空氣相色譜法對(duì)混合樣品進(jìn)行分離測(cè)定。如圖3所示,按照1.4.1設(shè)定儀器工作條件,氫氣、氧氣和氮?dú)饪梢酝耆蛛x,氫氣、氧氣和氮?dú)獾谋A魰r(shí)間分別為(1.0±0.1)min、(1.4±0.1)min、(2.1±0.1)min。3.0 min之內(nèi)即可完成樣品的測(cè)定,是一種可以快速有效的分離測(cè)定氫氣濃度的方法。

圖3 氣相色譜檢測(cè)圖Fig.3 Mass spectrum of hydrogen gas analyzed by gas chromatogram

2.3.2平衡時(shí)間對(duì)于產(chǎn)氫的影響 為了確定HRW中氫氣完全從超純水中逸散的平衡條件,測(cè)定不同平衡時(shí)間下頂空中的氫氣濃度。如圖4所示,在37 ℃、500 r·min-1條件下平衡10 min即可達(dá)到Henry平衡。

圖4 不同平衡時(shí)間對(duì)氣相檢測(cè)氫氣濃度的影響Fig.4 The effect of equilibrium time on the detection of HRW by gas chromatogram

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用氣相色譜分別測(cè)定高濃度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低濃度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氫氣的濃度。以HRW中氫氣的濃度為縱坐標(biāo),以氣相色譜峰面積為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5 A所示,高濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線性方程為y=1.642×10-6x-0.047 78,R2=0.996 2。如圖5B所示,低濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.961×10-6x-0.005 294,R2=0.999 7。因此,結(jié)果表明,低濃度、高濃度HRW中氫氣濃度與氣相色譜峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

2.3.4精確度分析 按照1.4.1設(shè)定儀器工作條件,對(duì)某一高濃度(0.72 mg·L-1)、低濃度(0.002 5 mg·L-1)樣品進(jìn)行9次平行測(cè)定,對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行精確度分析。由表3可知,在0~1.620 0 mg·L-1范圍內(nèi),該方法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.052 0 mg·L-1,變異系數(shù)為7.694 5%。結(jié)果表明該方法精確度較高,滿足水相中高濃度氫氣的測(cè)定要求。

由表3可知,在0~0.202 5 mg·L-1濃度范圍內(nèi),該方法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.000 3 mg·L-1,變異系數(shù)為9.926 7%。根據(jù)1.5中的公式,標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.000 3 mg·L-1,t(8,1-a=0. 99)=3.355 0,MDL=S×t(8,1-a=0. 99)=0.000 9 mg·L-1。表明該方法精確度較高,滿足水相中低濃度氫氣的測(cè)定要求。

圖5 氣相色譜法檢測(cè)HRW中氫氣濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of detecting hydrogen concentration in HRW by gas chromatogram

表3 氣相色譜檢測(cè)高濃度和低濃度HRW精密度分析Table 3 Accuracy analysis of high concentration and low concentrantion HRW detection by gas chromatogram

3 討論

本研究建立了使用氫氣微電極以及氣相色譜測(cè)定水相中氫氣濃度的方法。2種方法對(duì)于高濃度和低濃度HRW中氫氣的檢測(cè)均具有良好的線性關(guān)系。電極法測(cè)定高濃度、低濃度的HRW的變異系數(shù)分別為1.775 3%、11.734 0%,氣相色譜法測(cè)定高濃度、低濃度的HRW的變異系數(shù)分別為7.694 5%、9.926 7%,電極法及氣相色譜法的樣品方差均在12%以內(nèi),因此2種方法均可以精確測(cè)定溶液中氫氣的濃度。

氣相色譜法對(duì)水相中氫氣濃度的MDL為0.000 9 mg·L-1,高于電極法的0.004 4 mg·L-1,表明氣相色譜法更適用于對(duì)水相中低氫氣濃度的測(cè)定。但是從檢測(cè)方式來看,電極法可以直接實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水相中氫氣的濃度;氣相色譜法只能通過測(cè)定頂空氫氣進(jìn)而間接得到溶液中的氫氣濃度,無法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。從測(cè)定原理來看,電極法根據(jù)溶液中氧化還原電位的變化而測(cè)定溶液中氫氣的含量,由于生物樣本成分較為復(fù)雜,電極法的測(cè)定結(jié)果容易受到多種因素的干擾;而氣相色譜法是先將氫氣與其他物質(zhì)在色譜柱上進(jìn)行分離,再通過靈敏度高、重復(fù)性好的BID進(jìn)行分析,能夠?qū)崿F(xiàn)快速完成永久性氣體的檢測(cè)。綜上所述,對(duì)于需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的樣品,使用氫微電極法較為合適;對(duì)于成分復(fù)雜或者氫氣濃度較低的樣品,則可優(yōu)先選擇氣相色譜法。

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