馬星宇，嵇玉潔，薛玉瑩，杜孟芳，魏紀(jì)珍，尹新明，劉曉光，安世恒

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室，鄭州 450002)

0 引 言

【研究意義】棉鈴蟲Helicoverpaarmigera，是棉花、玉米、番茄和煙草作物上危害較為嚴(yán)重的一類雜食性害蟲。近年來，國內(nèi)玉米等夏季作物種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，棉鈴蟲抗藥性有加重趨勢，用藥不規(guī)范及過量用藥等問題突出，其對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失逐年增加[1-2]。鞣化激素(bursicon)是由異源二聚體蛋白組成的一類神經(jīng)肽類激素，在昆蟲表皮發(fā)育及鞣化過程中扮演重要角色。了解昆蟲體內(nèi)重要激素的功能機制，對田間害蟲綠色防控提供新靶標(biāo)有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】昆蟲的體壁(外骨骼)不但能夠避免蟲體內(nèi)水分的散失，而且能夠有效抵御外界病原微生物的入侵、降低蟲體遭受的環(huán)境機械物理傷害程度[3]。真皮細(xì)胞分泌形成的新表皮通常柔軟脆弱，蟲體得以延伸后，新表皮在短時間內(nèi)被迅速鞣化，保護昆蟲免受外界傷害[4]。Fraenkel和Hsiao[5](1962)對剛羽化的紅頭麗蠅Calliphoraerythrocephala頸部結(jié)扎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其胸部和腹部表皮不能正常黑化，F(xiàn)raenkel 和Hsiao(1965)隨后將導(dǎo)致這一現(xiàn)象的鞣化因子命名為鞣化激素(Bursicon，burs)[6]。除昆蟲外，有關(guān)鞣化激素在甲殼類動物[7]、蛛形綱[8]和棘皮動物中也有報道[9]。昆蟲在幼(若)蟲各齡期及變態(tài)期均需蛻去舊表皮，形成新表皮，最終形成完整的外骨骼。此過程包含兩個階段，即前蛻皮期(pre-ecdysis)和蛻皮期(ecdysis)。其間有眾多荷爾蒙(激素)參與蛻皮和新表皮的鞣化形成。蛻皮前期，蟲體血淋巴中蛻皮激素(ecdysone，Ecd)滴度急速下降，蛻皮觸發(fā)激素(ecdysis-triggering hormone，ETH)隨之也釋放出來[10]。Ecd與ETH的滴度變化進一步促進了羽化激素(eclosion hormone，EH)EH合成與釋放，同時EH又促進ETH的分泌，這些激素共同作用，形成一個正調(diào)控循環(huán)，協(xié)同促進昆蟲進行蛻皮[11]。EH又促進了甲殼類動心肽(crustacean car-dioactive peptide，CCAP)轉(zhuǎn)錄與活性多肽的釋放，隨著CCAP滴度的升高，預(yù)示著激素參與前蛻皮階段進入尾聲，蛻皮前期信號途徑關(guān)閉。接下來昆蟲進入蛻皮期，CCAP促進了鞣化激素達(dá)進，分泌的鞣化激素入血淋巴，與靶標(biāo)受體結(jié)合后，迅速引起cAMP水平上升，進而并增強昆蟲心臟的脈動，開啟鞣化激素調(diào)控昆蟲表皮鞣化的蛻皮后階段[12-15]。在參與昆蟲蛻皮過程眾多激素中，鞣化激素較為特殊，它是一類天然異源二聚體肽類激素，由α亞基(Bursicon，burs)和β亞基(partner of burs，pburs)組成，可形成胱氨酸結(jié)構(gòu)[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，其在腦、心側(cè)體、咽側(cè)體、胸神經(jīng)節(jié)以及腹部神經(jīng)節(jié)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)部位的勻漿中均檢測到具有活性多肽[18]。利用鞣化激素特異性抗體和DNA探針，Dewey等[19](2004)發(fā)現(xiàn)，其在煙草天蛾Manducasexta、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster等昆蟲咽下神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)以及腹神經(jīng)節(jié)均能夠合成burs和pburs。除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，鞣化激素在黑腹果蠅D.melanogaster中腸內(nèi)分泌細(xì)胞也有表達(dá)，且在功能上與中樞神經(jīng)互相獨立。在激素水平上，幾乎所有昆蟲鞣化激素均由中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成并釋放到血淋巴中，經(jīng)由血淋巴循環(huán)到達(dá)目標(biāo)組織或細(xì)胞，發(fā)揮功能[20]?！颈狙芯壳腥朦c】影響棉鈴蟲幼蟲生長發(fā)育的一些重要基因仍有待挖掘，如鞣化激素在棉鈴蟲中尚未報道。目前，國內(nèi)外對鞣化激素的研究主要集中于煙草天蛾M.sexta[21]、黑腹果蠅D.melanogaster[22]、赤擬谷盜Triboliumcastaneum[23]、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella[24]、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi[25]、桃蚜Myzuspersicae[26]、南亞實蠅Zeugodacustau[27]等模式昆蟲，對棉鈴蟲幼蟲生長發(fā)育調(diào)控功能的研究相對薄弱。研究利用分子生物學(xué)與生物信息學(xué)技術(shù)，獲取棉鈴蟲鞣化激素相關(guān)序列?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以棉鈴蟲為材料，研究該基因的分子特性。利用分子生物學(xué)與生物信息學(xué)技術(shù)分析棉鈴蟲鞣化激素的2個亞基全長序列。利用qRT-PCR技術(shù)，研究鞣化激素α與β亞基在棉鈴蟲不同發(fā)育階段和不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平，為研究鞣化激素相關(guān)基因的分子特性和功能，以及激素引起的昆蟲代謝通路和分子調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx

棉鈴蟲為室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度(26±1)℃，相對濕度65%，光周期16L∶8D。

1.1.2 主要試劑

總RNA提取試劑(Trizol Reagent)購自Invertrigen公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ABI公司；2×TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、HandШ等)、pMD19-T載體、DNA Marker、熒光定量試劑盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，使用的其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方 法

1.2.1 棉鈴蟲鞣化激素基因的獲得及同源序列

實驗室前期獲得的棉鈴蟲轉(zhuǎn)錄組unigene建立本地數(shù)據(jù)庫，利用家蠶鞣化激素氨基酸序列(GenBank登錄號，α亞基NP_001091845.1；β亞基NP_001037289.1)作為誘餌蛋白分別進行本地核苷酸t(yī)Blastn檢索比對，釣取棉鈴蟲候選基因核苷酸序列，將e值<1的序列逐個在線同源比對，將序列同源比對結(jié)論為鞣化激素的候選序列進一步分析，獲得棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基候選cDNA序列，與棉鈴蟲基因組數(shù)據(jù)庫比對，驗證其正確性；搜集其他已知昆蟲鞣化激素氨基酸序列，根據(jù)搜集到的鞣化激素氨基酸序列，在MEGA 7(7. 0.14)軟件中，選擇Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型，利用最大相似法(maximum likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行聚類分析[27]。

1.2.2 棉鈴蟲不同發(fā)育期組織樣品解剖

在棉鈴蟲卵期至成蟲期收集不同發(fā)育期蟲體(卵)，包括雌性成蟲新產(chǎn)下的卵(2 h內(nèi))作為第1 d，其余依次后推(卵期1～3 d)，幼蟲期各齡(包含蛻皮期)、蛹(包含預(yù)蛹期)與成蟲(羽化后前2 d成蟲)，卵期取整卵(50粒為1組，其余5頭1組，共3次重復(fù))。

1.2.3 棉鈴蟲5齡幼中樞神經(jīng)組織樣品解剖

腦與神經(jīng)組織樣品解剖選擇在5齡幼蟲第3 d，在“T”視鏡(萊卡)視野下下將幼蟲用昆蟲針固定，顯微解剖鑷解剖中樞神經(jīng)系統(tǒng)，分別解剖腦、咽下神經(jīng)節(jié)(1節(jié))、胸神經(jīng)節(jié)(3節(jié))、腹神經(jīng)節(jié)(7節(jié))，立即置于Trizol試劑中(30頭為1組次，共3次重復(fù))。

1.2.4 鞣化激素α與β亞基基因不同發(fā)育期與神經(jīng)組織表達(dá)

獲得的棉鈴蟲α與β亞基基因序列設(shè)計特異性引物，以棉鈴蟲內(nèi)參引物18S rRNA(GenBank: KT343378)為研究中內(nèi)參引物[28]。設(shè)計棉鈴蟲其它引物及對照引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將不同發(fā)育期和5齡幼蟲第3 d中樞神經(jīng)組織樣品取出備用，對于不同發(fā)育期樣品的處理，先用液氮在研缽里充分研磨，取混勻后適量樣品分別放入含有400～900 μL不等Trizol Reagent的PE管中；對于中樞神經(jīng)組織的處理，直接在無RNA酶的離心管中加液氮迅速冷凍，充分研磨。分別提取得到相應(yīng)的總RNA，取1 μL用NanoDropTM檢測，依次記錄其濃度和RNA質(zhì)量，保證OD260/OD280比值在2.0左右。獲得的各組織總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA: g DNA Eraser Buffer 2 μL, 1 μL g DNA Eraser, 0.8 μg不同組織的總RNA, 6.2 μL RNase free dH2O，配制成10 μL體系，42℃反應(yīng)2 min，冰上加入5×PrimeScript?Buffer 2 μL, PrimeScript?RT Enzyme MixⅠ1 μL, RT Primer Mix 1 μL, RNase free dH2O4μL?；旌暇鶆蚝笤?7℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，樣品-80℃保存以備qRT-PCR使用。不同基因表達(dá)水平檢測采用ABI7500 qRT-PCR儀(ABI, Carlsbad, CA, 美國)。以18S rRNA作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系10 μL: SYBRPremixExTaqTM(2×)5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板0.5 μL, DEPC處理過的滅活ddH2O 4.5 μL。擴增條件: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性15 s, 60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計40個循環(huán)，溶解曲線分析后除去非特異性樣品數(shù)據(jù)，每樣品次3個技術(shù)重復(fù)，重復(fù)3次。利用2-△△Ct方法分析基因轉(zhuǎn)錄的差異，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct處理-△Ct參考基因[28-29]。 表1

表1 設(shè)計引物Table 1 Primers designed for research

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果參照Yue等(2016)和Du等(2017)統(tǒng)計學(xué)分析方法[30-31]，即取3次生物學(xué)實驗重復(fù)，誤差計算3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差；數(shù)據(jù)處理首先采用DPS軟件(DPS7.05單機版)進行分析處理，不同時間點兩兩間的差異顯著采用獨立樣本t檢驗，不同數(shù)據(jù)間差異顯著采用單因素方程分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲鞣化激素基因序列及系統(tǒng)進化

利用棉鈴蟲轉(zhuǎn)錄組unigene序列建立核苷酸本地BLAST數(shù)據(jù)庫，以家蠶鞣化激素不同亞基氨基酸序列為誘餌蛋白，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中分別調(diào)取棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基同源基因cDNA序列。通過與棉鈴蟲基因組核苷酸序列比對，分別確認(rèn)并獲得棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基基因cDNA全長序列。其中α亞基cDNA全長為694 bp，其中開放閱讀框全長480 bp，編碼159個氨基酸殘基，預(yù)測該蛋白質(zhì)分子量分別為17.7 kDa；β亞基cDNA全長為779 bp，其中開放閱讀框全長420 bp，編碼139個氨基酸殘基，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為15.9 kDa。將棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基基因核苷酸序列提交GenBank，分別獲得序列登錄號: AHM0247472.1和AHM0247473.1。圖1，圖2

注(Note)：黑色陰影表示100%一致，灰色為50%～90%，白色為50%以下
Amino acids 100% identical are in black box, 50%-90% identical in grey box and identi cal below 50% in white box
Bb家蠶Bombyxmori(NP_001091845.1); Ms煙草天蛾Manducasexta(XP_030027854.1)；Hv煙芽夜蛾Heliothisvirescens(PCG80721.1)；Ha棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(AHM02472.1) ；Bg德國小蠊Blattellagermanica(PSN41953.1)；Ls灰飛虱Laodelphaxstriatellus(AXF48185.1)；Dm黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_650983.1)；Tc赤擬谷盜Triboliumcastaneum(ABA40402.1)；Am意大利蜜蜂Apismellifera(NM_001098234.1)
圖1 棉鈴蟲與其他昆蟲鞣化激素α亞基氨基酸同源比對
Fig. 1 Multiple sequence alignment of Bursicon-αfromH.armigerawith the homologs in other insects

注(Note)：黑色陰影表示100%一致，灰色為50%～90%，白色為50%以下
Amino acids 100% identical are in black box, 50%-90% identical in grey box and identical below 50% in white box
Bb 家蠶Bombyxmori(NP_001037289.1); Ms煙草天蛾Manducasexta(XP_030027856.1)；Hv煙芽夜蛾Heliothisvirescens(PCG80722.1)；Ha棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(AHM02473.1) ;Ls灰飛虱Laodelphaxstriatellus(AXF48186.1)；Dm黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_609712.1)；Am意大利蜜蜂Apismellifera(NP_001035352.2);Tc赤擬谷盜Triboliumcastaneum(NP_001107780.1)；Bg德國小蠊Blattellagermanica(PSN41954.1)
圖2 棉鈴蟲與其他昆蟲鞣化激素β亞基氨基酸同源比對
Fig. 2 Multiple sequence alignment of Bursicon-βfromH.armigerawith the homologs in other insects

研究表明，棉鈴蟲鞣化激素α亞基與其它昆蟲中該基因所編碼氨基酸序列一致性在53%以上，其中與煙蚜夜蛾Heliothisvirescens氨基酸序列一致性最高，為94%，其次是家蠶Bombyxmori一致性為74%，與家蠶Bombyxmori一致性為69%，與德國小蠊Blattellagermanica、灰飛虱Laodelphaxstriatellus、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、赤擬谷盜Triboliumcastaneum和意大利蜜蜂Apismellifera等氨基酸序列一致性較低，分別為59%、56%、53%、56%和53%。棉鈴蟲鞣化激素α亞基與家蠶等鱗翅目昆蟲該基因很好地聚在一起，以果蠅D.melanogaster為代表的雙翅目、以赤擬谷盜為代表的鞘翅目、以白蟻和蟑螂為代表的蜚蠊目同時分別很好的聚在了一起，而意大利蜜蜂單獨聚為一支。圖3

注(Note)：Bb家蠶Bombyxmori(NP_001091845.1); Ms煙草天蛾Manducasexta(XP_030027854.1)；Cs二化螟Chilosuppressalis(ALM30306.1)； Hv煙芽夜蛾Heliothisvirescens(PCG80721.1)；Tn粉紋夜蛾Trichoplusiani(XP_026733509.1); Ha棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(AHM02472.1) ；Gm蠟螟Galleriamellonella(XP_026749033.1)；Px小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(AJM76770.1)；Cp蘋果蠹蛾Cydiapomonella(QDK59883.1)；Zn濕木白蟻Zootermopsisnevadensis(XP_021930557.1)；Bg德國小蠊Blattellagermanica(PSN41953.1)；Ls灰飛虱Laodelphaxstriatellus(AXF48185.1)；Bd橘小實蠅Bactroceradorsalis(XP_029409224.1)；Zt南亞實蠅Zeugodacustau(QBE90576.1)；Nl褐飛虱Nilaparvatalugens(XP_022197712.1)；Dm黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_650983.1)；Agl光肩星天牛Anoplophoraglabripennis(XP_018569360.1)；Tc赤擬谷盜Triboliumcastaneum(ABA40402.1)；Aga岡比亞按蚊Anophelesgambiae(Q66Q82.1)； Ld馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata(XP_023014168.1)；So米象Sitophilusoryzae(XP_030754853.1)；Aa埃及伊蚊Aedesaegypti(P85316.1)；Rm禾谷縊管蚜Rhopalosiphummaidis(XP_026815117.1)；Am意大利蜜蜂Apismellifera(NM_001098234.1); Mp桃蚜Myzuspersicae(XP_022171710.1)
圖3 最大相似法構(gòu)建的基于昆蟲鞣化激素α亞基氨基酸序列系統(tǒng)進化樹 (MEGA ver. 7.0.14, 1 000次重復(fù))
Fig. 3 Molecular phylogenic analysis of the burs-αfrom different insect species based on amino acid sequences by maximum likelihood method (MEGA ver. 7.0.14, 1，000 replicates)

而棉鈴蟲鞣化激素β亞基與其它昆蟲中該基因所編碼氨基酸序列一致性也在在43%以上。序列比對還發(fā)現(xiàn)，與煙蚜夜蛾H.virescens氨基酸序列一致性最高，達(dá)97%，家蠶B.mori和煙草天蛾M.sexta，一致性69%。與α亞基序列分析一致，鞣化激素β亞基在夜蛾科中首先聚在一起，然后再螟蛾科大拉螟G.mellonella和二化螟C.suppressalis聚在一起。其次與同屬蠶蛾科的家蠶B.mori、天蛾科的煙草天蛾M.sexta聚在一起，最后與卷蛾科的蘋果蠹蛾C.pomonella、菜蛾科小菜蛾P(guān).xylostella等其它鱗翅目害蟲聚在一起，形成一個龐大的鱗翅目家族。以赤擬谷盜為代表的鞘翅目、以果蠅為代表的雙翅目、以白蟻和蟑螂為代表的蜚蠊目等昆蟲均很好的聚在了一起。以蜜蜂為代表的膜翅目單獨聚為一支。這與鞣化激素氨基的酸序列同源聯(lián)配分析結(jié)果相一致。圖4

在棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基氨基酸序列中也發(fā)現(xiàn)具有典型的鞣化激素胱氨酸蛋白結(jié)構(gòu)，其中半胱氨酸C1與C7，C2與C8，C3與C9，C4與C10，C5與C11可通過二硫鍵相連接。圖4

注(Note)：Bb 家蠶Bombyxmori(NP_001037289.1); Ms煙草天蛾M.sexta(XP_030027856.1)；Hv煙芽夜蛾H.virescens(PCG80722.1)；Ha棉鈴蟲H.armigera(AHM02473.1) ; Tn粉紋夜蛾T.ni(XP_026733510.1)；Gm蠟螟G.mellonella(XP_026749002.1)；Cs二化螟C.suppressalis(ALM30307.1); Px小菜蛾P(guān).xylostella(AJM76771.1)；Cp蘋果蠹蛾C.pomonella(QDK59884.1)；So米象S.oryzae(XP_030754854.1)；Ld馬鈴薯甲蟲L.decemlineata(XP_023014169.1)；Ls灰飛虱L.striatellus(AXF48186.1)；Agl光肩星天牛A.glabripennis(XP_018569361.1)；Nl褐飛虱N.lugens(XP_022190952.1)；Aa埃及伊蚊Aedesa.(XP_001663910.1)；Dm黑腹果蠅D.melanogaster(NP_609712.1)；Mp桃蚜M.persicae(XP_022171709.1)；Zn濕木白蟻Z.nevadensis(XP_021930558.1)；Rm禾谷縊管蚜R.maidis(XP_026815130.1)；Zt南亞實蠅Z.tau(QBE90577.1)；Bd橘小實蠅B.dorsalis(XP_011213771.1)；Am意大利蜜蜂A.mellifera(NP_001035352.2); Aga岡比亞按蚊A.gambiae(CAH74225.1)；Tc赤擬谷盜T.castaneum(NP_001107780.1)；Bg德國小蠊B.germanica(PSN41954.1)
圖4 最大相似法構(gòu)建的基于昆蟲鞣化激素β亞基氨基酸序列系統(tǒng)進化樹 (MEGA ver. 7.0.14, 1 000次重復(fù))
Fig. 4 Molecular phylogenic analysis of the burs-βfrom different insect species based on amino acid sequences by maximum likelihood method (MEGA ver. 7.0.14, 1，000 replicates)

2.2 棉鈴蟲鞣化激素基因在不同發(fā)育期相對表達(dá)模式

研究表明，棉鈴蟲鞣化激素α基因在卵期第3 d、1齡幼蟲第2 d、2齡幼蟲第1 d、3～5幼蟲第1 d；2齡和3齡末蛻皮期(3M、4M)、蛹期第0 d、第3 d和第7 d表達(dá)量相對較高，自蛹期第7 d至成蟲羽化后相對表達(dá)量開始下降。圖5

而棉鈴蟲鞣化激素β基因在卵期至2齡末蛻皮期(3M)持續(xù)高水平表達(dá)。自3齡第1 d始迅速下降，但在3齡幼蟲第2 d、4與5齡幼蟲第1 d相對表達(dá)量較高；自蛹期第1 d開始至羽化前表達(dá)量相對較高，羽化后成蟲體內(nèi)相對表達(dá)量開始下降。圖6

注(Note):E1～ 3: 分別為1～ 3日齡卵1～3-d～ay-old egg, respectively; 1-1～2: 分別為1齡幼蟲第1～ 2 dDay 1～ 2 1st instar larva, respectively; 2-1～ 2: 分別為2齡幼蟲第1～ 2 dDay 1～ 2 2nd instar larva, respectively; 3-1～ 2:分別為3齡幼蟲第1～ 2 dDay 1- 2 3rd instar larva, respectively; 4-1～ 2:分別為4齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 4th instar larva, respectively; 5-1～5:分別為5齡幼蟲第1～5 dDay 1～5 5th instar larva, respectively; M: 蛻皮期Molting stage; PP: 預(yù)蛹期Pre-pupal stage; P0～10: 化蛹后0～10 d0～10 d after pupation; A1～2: 分別為1和2日齡成蟲1～2-day-old adult. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母代表基因表達(dá)差異顯著(P<0.01; ANOVA和Tukey氏檢驗)。Data in the figure are mean±SE. Statistically significant differences are denoted by different capital letters (ANOVA and Tukey's test,P<0.01)
圖5 鞣化激素-α亞基基因在棉鈴蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)水平
Fig. 5 Developmental expression profiles of bursion-αin H. armigera

注(Note): E1-3: 分別為1～3日齡卵1-3-day-old egg,respectively; 1-1～2: 分別為1齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 1st instar larva, respectively; 2-1～2: 分別為2齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 2nd instar larva, respectively; 3-1～2:分別為3齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 3rd instar larva, respectively; 4-1～2:分別為4齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 4th instar larva, respectively; 5-1～5:分別為5齡幼蟲第1～5 dDay 1～5 5th instar larva, respectively; M: 蛻皮期Molting stage; PP: 預(yù)蛹期Pre-pupal stage; P0～10: 化蛹后0～10 d，0-10 d after pupation; A1～2: 分別為1和2日齡成蟲1～2-day-old adult. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母代表基因表達(dá)差異顯著(P<0.01; ANOVA和Tukey氏檢驗)。Data in the figure are mean±SE. Statistically significant differences are denoted by different capital letters (ANOVA and Tukey's test,P<0.01)
圖6 鞣化激素-β亞基基因在棉鈴蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)水平
Fig. 6 Developmental expression profiles ofburs-βin H. armigera

2.3 棉鈴蟲鞣化激素α亞基、β亞基在棉鈴蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相對表達(dá)量

研究表明，在棉鈴蟲胸神經(jīng)節(jié)中的相對表達(dá)量較高，尤其是在胸神經(jīng)節(jié)第2節(jié)中表達(dá)量最高，其次是第3節(jié)，第1節(jié)也有較高水平；咽下神經(jīng)節(jié)相對表達(dá)量低于胸神經(jīng)節(jié)前相對表達(dá)量，但顯著高于腦部與腹部表達(dá)量，腹神經(jīng)節(jié)也有不同程度表達(dá)，但總體相對較弱。圖7

注；Br：腦；SOG：食管下神經(jīng)節(jié)；TG：胸神經(jīng)節(jié)；AG：腹神經(jīng)節(jié)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母代表基因表達(dá)差異顯著(P<0.05; ANOVA和Tukey氏檢驗)
Note:Data in the figure are mean±SE. Statistically significant differences are denoted by different capital letters (ANOVA and Tukey's test,P<0.05)
圖7 鞣化激素-α在棉鈴蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相對表達(dá)水平
Fig. 7 Relative expression levels of bursion-αin nervous system ofH.armigera

注；Br：腦；SOG：食管下神經(jīng)節(jié)；TG：胸神經(jīng)節(jié)；AG：腹神經(jīng)節(jié)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母代表基因表達(dá)差異顯著(P<0.05; ANOVA和Tukey氏檢驗)
Note:Data in the figure are mean±SE. Statistically significant differences are denoted by different capital letters (ANOVA and Tukey's test,P<0.05)
圖8 鞣化激素β亞基基因在棉鈴蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相對表達(dá)水平
Fig. 8 Relative expression levels of bursion-βin nervous system ofH.armigera

對于β亞基而言，表達(dá)模式與α亞基具有一致性，β亞基在胸神經(jīng)節(jié)中相對較高，咽下神經(jīng)節(jié)次之，腦部和腹部相對表達(dá)量較弱，其中腹部第1節(jié)與第3節(jié)、第4節(jié)和第7節(jié)差異不顯著，但與腦部表達(dá)量有顯著差異；除腹部第1節(jié)外，其余腹部相對表達(dá)量差異不顯著。圖8

3 討 論

昆蟲在不同蟲態(tài)及生長發(fā)育過程中，離不開舊表皮的蛻去和新表皮的的形成。在此過程中，鞣化是一個必不可缺的復(fù)雜的生理過程，鞣化包括黑化和硬化兩個相對獨立的過程，硬化的表皮既可以維持昆蟲的形態(tài)，也可以抵御外界病原物的入侵[3]。鞣化激素的發(fā)現(xiàn)及研究至今已經(jīng)有50多年的時間，目前，對鞣化激素的研究多集中于果蠅、赤擬谷盜、煙草天蛾等模式昆蟲，而且有關(guān)同聚體的功能還未完全清楚。

以重要農(nóng)業(yè)害蟲棉鈴蟲為研究材料，依據(jù)幼蟲神經(jīng)組織轉(zhuǎn)錄組unigene建立了本地核苷酸數(shù)據(jù)庫，根據(jù)同源克隆的方法，利用生物信息學(xué)技術(shù)獲得了棉鈴蟲α亞基和β亞基的全長序列，其α亞基基因全長為694 bp,其中開放閱讀框全長480 bp，編碼160個氨基酸殘基，β亞基基因全長為779 bp,其中開放閱讀框全長420 bp，編碼140個氨基酸殘基。對氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，α亞基和β亞基均含有保守的半胱氨酸殘基，其它氨基酸序列也相對比較保守，鞣化激素在鱗翅目昆蟲之間不僅保守，也可能具有一定的跨物種活性，對昆蟲的生長發(fā)育有不可替代的作用。

通過qPCR檢分析鞣化激素α亞基和β亞基在棉鈴蟲體內(nèi)的時空表達(dá)模式，結(jié)果表明，二者在棉鈴蟲各個發(fā)育階段均有表達(dá)，但在卵期和蛹期表達(dá)量相對較高，這與之前在果蠅和家蠶中的鞣化激素在蛹期表達(dá)量較高的研究中得到的結(jié)論基本相符[19，32]。鞣化激素在蛹期較高水平表達(dá)，可能與棉鈴蟲羽化后成蟲體壁的鞣化和翅的延展有關(guān)；鞣化激素在棉鈴蟲卵期高水平表達(dá)，可能為卵殼的硬化和黑化做準(zhǔn)備。此外，檢測棉鈴蟲神經(jīng)系統(tǒng)的各個神經(jīng)節(jié)發(fā)現(xiàn)，鞣化激素主要是由胸部神經(jīng)節(jié)合成的，但是在腦和腹部神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量極低，有研究表明，美洲大蠊和煙草天蛾的胸神經(jīng)節(jié)和腹部神經(jīng)節(jié)均檢測到鞣化激素的較高表達(dá)[16，21]，這可能與物種間的的個體差異有關(guān)，棉鈴蟲鞣化激素α亞基和β亞基在幼蟲及成蟲期的生理與生化功能還需進一步驗證。

4 結(jié) 論

鞣化激素在昆蟲之間具有較高的保守性，與其它已知昆蟲發(fā)表序列類似，棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基氨基酸序列中也發(fā)現(xiàn)具有典型的鞣化激素胱氨酸蛋白結(jié)構(gòu)，其中半胱氨酸C1與C7，C2與C8，C3與C9，C4與C10，C5與C11可通過二硫鍵相連接。鞣化激素在棉鈴蟲各個發(fā)育階段均有表達(dá)，其中α亞基在卵期第3 d、1齡幼蟲第2 d、2齡幼蟲第1 d、3～5齡幼蟲第1 d； 2齡和3齡末蛻皮期(3M、4M)、蛹期第0 d、第3 d和第7 d表達(dá)量相對較高。而β亞基在卵期至2齡末蛻皮期(3M)持續(xù)高水平表達(dá)，在3齡幼蟲第2 d、4與5齡幼蟲第1 d和蛹期表達(dá)量相對較高。鞣化激素主要是由棉鈴蟲幼蟲胸部神經(jīng)節(jié)合成的，在腦和腹部神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量極低。