嵇玉潔，馬星宇，宋永輝，杜孟芳，魏紀(jì)珍，尹新明，劉曉光，安世恒

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002)

0 引 言

【研究意義】鞣化激素(Bursicon，burs)是一類天然異源二聚體多肽類激素，在昆蟲及甲殼綱動(dòng)物中普遍存在[1]。昆蟲表皮發(fā)育及鞣化，需要在諸多激素及其受體參與的一系列信號(hào)通路協(xié)同下完成，其中鞣化激素作為該通路中的重要成員之一，還參與免疫等其它重要功能[1-2]。對(duì)棉鈴蟲鞣化激素β亞基(burs-β)及其表達(dá)的同聚體激素進(jìn)行研究，為研究其參與幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育提供理論基礎(chǔ)，且對(duì)降低鱗翅目免疫及抗性、有效控制害蟲，尋找新靶標(biāo)基因具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，α亞基(burs- )與β亞基組成的鞣化激素異源二聚體可以與其受體G蛋白偶聯(lián)受體Rickets特異結(jié)合，迅速激活環(huán)腺苷/蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A, cAMP/PKA)信號(hào)通路，PKA進(jìn)一步激活下游關(guān)鍵基因，參與昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育[3-4]。2個(gè)亞基也可在體內(nèi)形成α亞基或β亞基同源二聚體[2-3]。與其異源二聚體有所不同，鞣化激素同源二聚體以誘導(dǎo)體內(nèi)某些抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄變化，參與免疫應(yīng)答反應(yīng)[4]。對(duì)頸部結(jié)扎的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)注射重組burs-β，能引起一系列免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，并且所引起免疫反應(yīng)的強(qiáng)度同注射重組蛋白的劑量和時(shí)間有關(guān)。將注射重組鞣化激素蛋白的蟲體勻漿液，與革蘭氏陰性菌Escherichiacoli共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能夠顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[4]。表皮鞣化是伴隨著蛻皮而發(fā)生的。由于天敵的襲擊或者簡(jiǎn)單的接觸損傷都能對(duì)昆蟲柔軟表皮造成不同程度的傷害，抗菌肽強(qiáng)有力的防御作用是這個(gè)時(shí)期的昆蟲所必需的?？咕?Antimicrobial peptides，AMPs)是昆蟲天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[5]。昆蟲抗菌肽主要在脂肪細(xì)胞內(nèi)合成，在上皮細(xì)胞、生殖道、馬氏管和氣管等也有表達(dá)，其感染病原菌后隨即引起體內(nèi)上皮細(xì)胞、脂肪體誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽，這些抗菌肽通過分泌到淋巴液中執(zhí)行相關(guān)功能[6]。研究表明，burs介導(dǎo)角質(zhì)層鞣化和翅的伸展[7-9]，引起鞣化途徑中的cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑和酪氨酸羥化酶活化[10]。在黑腹果蠅(D.melanogaster)中，2條不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，即Toll和IMD(Immune deficiency)途徑，負(fù)責(zé)病原體的識(shí)別和抗微生物免疫反應(yīng)的激活[11]。burs通過激活轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，通過IMD途徑介導(dǎo)免疫反應(yīng)[4]。Buchon 等及Dutta 等[12-14]分別通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分析果蠅中腸和人細(xì)胞特異性表達(dá)譜數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α亞基在成蟲中腸內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，α亞基也可以與受體Rickets結(jié)合，引起cAMP的活性增加，而β亞基沒有表達(dá)，可能β亞基在此過程中是非必須的。鞣化激素兩種同源二聚體某些時(shí)候是以Rickets為直接受體結(jié)合，某些組織中似乎不是通過連接Rickets起作用的，該2種同源二聚體可能是經(jīng)由未發(fā)現(xiàn)的新的受體來調(diào)控抗菌肽表達(dá)的[4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】剛蛻皮的棉鈴蟲表皮是柔軟的(在表皮硬化和黑色素化之前)，并且更容易受到傷害和感染。此時(shí)可能由于微生物者或簡(jiǎn)單的接觸傷害而在軟角質(zhì)層中出現(xiàn)穿孔，幼蟲利用誘導(dǎo)抗菌防御措施，在此過程中，鞣化激素可能起著潛在的重要作用。研究棉鈴蟲鞣化激素β亞基參與脂肪組織免疫的相關(guān)功能基因表達(dá)模式?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以棉鈴蟲幼蟲作為材料，利用生物分子技術(shù)，對(duì)棉鈴蟲鞣化激素β亞基基因及其表達(dá)的burs-β同聚體蛋白進(jìn)行研究，為研究其參與幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育提供理論基礎(chǔ)，為降低鱗翅目免疫及抗性、有效控制害蟲，尋找新的靶標(biāo)基因提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx

棉鈴蟲為實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)種群，飼養(yǎng)條件：溫度(26±1)℃，相對(duì)濕度65%，光周期16 L∶8 D。

1.1.2 主要試劑與儀器

鞣化激素β亞基形成的同源二聚體(Bursicon-β，Burs-β)重組蛋白為實(shí)驗(yàn)室293T細(xì)胞真核表達(dá)?？俁NA抽提試劑(Trizol Reagent)購自Invertrigen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)購自TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(BamHI、HandIII等)、pMD19-T載體、熒光定量試劑盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)；DNA凝膠回收試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒、IPTG(異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)以及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)為上海生工生物公司產(chǎn)品；昆蟲組織培養(yǎng)液(Grace’s Insect Medium，Gibco公司)；研究使用的其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。PCR儀(Mastercycle Pro S型PCR儀購自德國Eppendorf公司)，Real time PCR儀(ABI, Carlsbad,CA美國)，超低溫離心機(jī)(Eppendorf德國Eppendorf)，紫外分光光度計(jì)(ND-2000,購自美國NanoDrop)，凝膠成像系統(tǒng)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床等均為國產(chǎn)普通品牌。

1.2 方 法

1.2.1 組織樣品獲得及cDNA模板的合成

在顯微鏡下用剖鑷解剖棉鈴蟲脂肪組織(約20頭，3次重復(fù))，立即置于Trizol試劑中，參照試劑盒說明，提取總RNA。將提取好的總RNA分別取1μL用NanoDropTM檢測(cè)，記錄各自濃度和RNA質(zhì)量，保證OD260/OD280比值在1.8左右。將獲得的各樣品總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA: gDNA Eraser Buffer 2 μL, 1 μL gDNA Eraser, 1 μg不同樣品總RNA, 6 μL RNase free dH2O，組成10 μL體系，42℃反應(yīng)2 min，冰上加入5×PrimeScript?Buffer 2 μL, PrimeScript?RT Enzyme MixⅠ1 μL, RT Primer Mix 1 μL, RNase free H2O 4 μL。將以上混合均勻后37℃孵育15 min，然后85℃孵育5 s，樣品在-80℃保存以備合成雙鏈RNA使用。

1.2.2 鞣化激素β亞基基因的獲得及dsRNA的合成

以前期獲得的棉鈴蟲轉(zhuǎn)錄組unigene建立本地?cái)?shù)據(jù)庫，利用已知家蠶鞣化激素β亞基的氨基酸序列(GenBank:NP_001037289.1)，作為誘餌蛋白進(jìn)行tBlastn搜索，釣取棉鈴蟲候選基因，獲得棉鈴蟲該基因cDNA序列，設(shè)計(jì)引物，引物合成均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

以棉鈴蟲cDNA 為模板，根據(jù)棉鈴蟲鞣化激素β亞基和EGFP序列設(shè)計(jì)普通PCR擴(kuò)增引物和含有 T7 啟動(dòng)子(斜體)序列的 RNAi 引物(表1)。合成方法參照姚雪等[15](2019)方法，首先用不含T7啟動(dòng)子的引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，將并PCR產(chǎn)物純化，切膠回收后將待干擾基因Burs-β片段與pMD19-T載體連接，對(duì)照采用實(shí)驗(yàn)室保存的含有EGFP基因片段序列的表達(dá)載體pNUS-EGFPcH(質(zhì)粒中EGFP的GenBank登錄號(hào)AY056838)，通過藍(lán)白斑篩選，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后備用。接下來分別以含有Burs-β與EGFP目的片段的pMD19- T質(zhì)粒為模板，分別以含有T7啟動(dòng)子序列的Burs-β與EGFP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接pMD-19T載體，通過藍(lán)白斑篩選，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后作為模板，以含有T7啟動(dòng)子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并純化PCR產(chǎn)物，然后用 MEGA script RNAi Kit (ABI公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，合成的Burs-β與EGFP dsRNA片段-20℃保存以備RNAi試驗(yàn)用。表1

表1 試驗(yàn)用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3Burs-β同聚體蛋白處理棉鈴蟲脂肪體引起相關(guān)免疫相關(guān)基因表達(dá)變化

根據(jù)獲得的Burs-β基因cDNA序列(未發(fā)表)設(shè)計(jì)熒光定量引物；同時(shí)根據(jù)wang等棉鈴蟲相關(guān)免疫基因序列(cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin)，設(shè)計(jì)了熒光定量引物[17-18]。

取棉鈴蟲5齡48 h幼蟲脂肪體組織，PBS清洗后放入組織培養(yǎng)液(Grace’s Insect Medium，Gibco公司)培養(yǎng)，將Burs-β同聚體重組蛋白處理體外培養(yǎng)的幼蟲脂肪體組織，Burs-β重組蛋白用DMSO懸浮溶解(Burs-β重組蛋白終濃度30 μg/mg組織)，處理不同時(shí)間(0.5、1和3 h)，對(duì)照用DMSO處理相同時(shí)間后分別取樣，將樣品立即置于Trizol試劑中、并迅速用液氮冷凍，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄。以各樣品cDNA為模版，以合成的qRT-PCR引物進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，18S rRNA(GenBank: KT343378)作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系10 μL: SYBRPremixExTaqTM(2×)5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板1 μL, 無RNA酶的雙蒸水 4 μL。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性15 s, 60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，各處理重復(fù)3次 。不同基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用ABI7500 qRT-PCR儀(ABI，Carlsbad，CA，美國)，以18S rRNA(GenBank：KT343378)作為內(nèi)參基因。利用2-△△Ct方法分析基因轉(zhuǎn)錄的差異，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct處理-△Ct參考基因[16]。 表1

1.2.4Burs-βdsRNA干涉后棉鈴蟲幼蟲后免疫相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

玻璃毛細(xì)管拉長(zhǎng)后固定在微量注射器末端，將合成的Burs-β雙鏈RNA注射入5齡第1 d棉鈴蟲幼蟲腹足，每頭幼蟲注射Burs-βdsRNA 30 μg，對(duì)照注射相同劑量的dsEGFP，分別在注射后24、48和72 h取脂肪體組織，每組注射10頭，共3次重復(fù)，保存在400 mL Trizol中，立即用液氮冷凍后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄備用。根據(jù)棉鈴蟲免疫相關(guān)基因Cecropin1(GU182916.1)、cecropin2(GU182909.1)、cecropin3(GU182910.1)、attacin(AY948540.1)、cecropinD(EU041763.1)、gloverin(GU182908.1)、defensin(KT346374.1)、moricin(GU182911.1)和lebocin(KT346375.1)設(shè)計(jì)引物[17-18]。以各樣品cDNA為模版，以合成的qRT-PCR引物進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系和方法同1.2.3，分析不同處理棉鈴蟲樣品中免疫相關(guān)基因(cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin)mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果參照Yue等和Du等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法[19-20]，即取3次生物學(xué)試驗(yàn)重復(fù)，誤差計(jì)算3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差；不同時(shí)間點(diǎn)兩兩間的差異顯著采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同數(shù)據(jù)間差異顯著采用單因素方程分析，數(shù)據(jù)處理首先采用DPS軟件(DPS7.05單機(jī)版)單因素方差分析(One-way analysis of variance, ANOVA)，接著進(jìn)行LSD檢驗(yàn)(Least Significant Difference)，P<0.001用“***”、P<0.01用“**”或大寫字母，P<0.05用*或小寫字母。

2 結(jié)果與分析

2.1 Burs- β同聚體蛋白處理棉鈴蟲脂肪體引起相關(guān)免疫相關(guān)基因表達(dá)變化

研究表明，幼蟲脂肪組織經(jīng)Burs-β同聚體蛋白處理后，免疫相關(guān)基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin隨著時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)錄水平具有相同的變化趨勢(shì)，即0.5內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平迅速上升，隨后在1后恢復(fù)至初始水平，在3內(nèi)與初始轉(zhuǎn)錄水平亦無顯著變化。圖1

2.2 幼蟲Burs- β dsRNA合成及注射棉鈴蟲后干擾效果檢測(cè)

以棉鈴蟲cDNA 為模板，以棉鈴蟲Burs-β和EGFP普通PCR引物作為首輪擴(kuò)增，測(cè)序正確后，以含有正確片段的質(zhì)粒作為模板，以含有 T7 啟動(dòng)子序列的 RNAi 引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，利用 MEGA script RNAi Kit 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，合成Burs-β與EGFP dsRNA片段，將合成產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，Burs-β與EGFP dsRNA片段分別在質(zhì)量在350 bp與520 bp ，與預(yù)測(cè)片段大小符合，dsRNA合成質(zhì)量良好。

將合成好的Burs-β與EGFP dsRNA注射5齡幼蟲腹足，在注射后24、48和72 h分別取脂肪體組織，利用qRT-PCR 的方法對(duì)干涉效果進(jìn)行檢測(cè)。qRT-PCR結(jié)果顯示，注射Burs-βdsRNA后，在24 與48 h，干涉效果不明顯，但在注射Burs-βdsRNA 72 h后，干涉效果極其顯著，內(nèi)源性Burs-β得到干涉。圖2

圖1Burs-β同聚體蛋白處理棉鈴蟲脂肪體引起相關(guān)免疫相關(guān)基因表達(dá)變化
Fig.1 Effect ofburs-βhomomer proteins on related immune genes transcript level of fat body tissue

M，DNA mark(DL2000), 1, dsEGFP, 2 dsP burs-β

圖2 棉鈴蟲dsburs-β基因RCR檢測(cè)結(jié)果
Fig.2 PCR product ofburs-βdsRNA gene

2.3 幼蟲注射 Burs- β dsRNA對(duì)棉鈴蟲免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

棉鈴蟲5齡1對(duì)注射Burs-βdsRNA，72 h檢測(cè)Burs-β干涉成功后，將注射后72 h作為研究免疫基因轉(zhuǎn)錄水平變化的檢測(cè)點(diǎn)，對(duì)相應(yīng)處理進(jìn)行取樣檢測(cè)，分析棉鈴蟲免疫相關(guān)基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin在幼蟲體內(nèi)Burs-β下調(diào)時(shí)的表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照轉(zhuǎn)錄水平相比，cecropin1在干涉后72 h顯著降低(P=0.001 7)；免疫相關(guān)基因cecropin2在72 h后轉(zhuǎn)錄水平也有相應(yīng)程度下調(diào)，與對(duì)照處理差異顯著(P=0.040 5)；免疫基因cecropin3在72 h后與對(duì)照相比顯著下調(diào)(P=0.008 8)；免疫基因attacin在72 h與對(duì)照相比差異顯著(P=0.008 1)； 免疫基因cecropinD在72 h后轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照相比差異顯著(P=0.048 3)；免疫基因gloverin在72 h后與對(duì)照相比下調(diào)顯著，達(dá)到極顯著差異(P=0.000 2)；免疫基因defensin在72 h后轉(zhuǎn)錄水平也有相應(yīng)程度下調(diào)，與對(duì)照處理差異顯著(P<0.004 9)；免疫基因moricin在72 h后轉(zhuǎn)錄水平也有相應(yīng)程度下調(diào)，與對(duì)照處理差異不顯著(P<0.058 2)；免疫基因lebocin在72 h后轉(zhuǎn)錄水平也有相應(yīng)程度下調(diào)，與對(duì)照處理差異顯著(P<0.045 5)。圖3，圖4

圖3Burs-βdsRNA注射幼蟲后不同時(shí)間內(nèi)干擾效果檢測(cè)
Fig.3 Effect ofburs-βexpression level ofHelicoverpaarmigeraafter treatment withburs-βdsRNA at different times

圖4 5齡幼蟲注射burs-βdsRNA 72 h后棉鈴蟲免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化
Fig.4 Related immune genes transcript level of fat body tissue in 5thlarval instar after 72 h injection withburs-βdsRNA

3 討 論

以棉鈴蟲為研究對(duì)象，以實(shí)驗(yàn)室保存的形成的同源二聚體為外源激素，體外處理棉鈴蟲5齡幼蟲脂肪體組織，發(fā)現(xiàn)處理后棉鈴蟲脂肪體內(nèi)免疫相關(guān)基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin在0.5 h內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平迅速上升，隨后恢復(fù)處理前轉(zhuǎn)錄水平。為驗(yàn)證Burs-β重組蛋白體外處理幼蟲脂肪體引起的相關(guān)免疫基因變化等現(xiàn)象，并探究這種轉(zhuǎn)錄水平上變化是否是因該激素直接引起，接下來體外合成了burs-β雙鏈RNA，注射幼蟲腹足，在確保72 h后幼蟲體內(nèi)Burs-βmRNA因降解而下調(diào)后，利用qRT-PCR分別檢測(cè)了脂肪組織中cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin和lebocin轉(zhuǎn)錄水平隨著Burs-βmRNA干擾下調(diào)而顯著下降，而moricin變化并不顯著。結(jié)果表明，一定濃度鞣化激素的刺激激活了免疫相關(guān)基因的迅速響應(yīng)與高水平表達(dá)。而當(dāng)鞣化激素水平相對(duì)較低時(shí)，大部分免疫相關(guān)基因響應(yīng)該激素的影響而降低表達(dá)水平，表明Burs-β的沉默能夠顯著抑制棉鈴蟲幼蟲體內(nèi)部分免疫相關(guān)基因的表達(dá)。

鞣化激素有α同源二聚體、β同源二聚體和β異源二聚體，除了其在表皮鞣化和翅的伸展方面的典型功能之外，組成鞣化激素的每個(gè)亞基還具有各自獨(dú)立的功能與作用[4,22]。Zhang 等[21]發(fā)現(xiàn)在埃及伊蚊Aedesaegypti中，鞣化激素通過其受體 Relish2 誘導(dǎo)抗菌肽基因的表達(dá)，從而有效地抑制體外細(xì)菌的生長(zhǎng)，起到預(yù)防性免疫作用。也有研究表明，Burs-β組成的同源二聚體經(jīng)由 IMD 路徑，通過激活轉(zhuǎn)錄因子Relish，調(diào)控免疫反應(yīng)。但其同源二聚體可能是通過新的受體來調(diào)控抗菌肽的表達(dá)[4]。

昆蟲體內(nèi)，抗菌肽主要由脂肪體和血細(xì)胞合成，在其他部位也有少量的合成[22]，以幼蟲脂肪體為研究對(duì)象，在取樣以及快速研究抗菌肽在轉(zhuǎn)錄水平上受鞣化激素影響方面提供了較為快捷的便利。

4 結(jié) 論

鞣化激素Burs-β組成的同源二聚體體外處理棉鈴蟲幼蟲脂肪組織激活了免疫相關(guān)基因的迅速響應(yīng)與過量表達(dá)。而利用RNAi技術(shù)注射幼蟲活體，當(dāng)鞣化激素基因轉(zhuǎn)錄由于干擾受到抑制、激素水平相對(duì)較低時(shí)，大部分免疫相關(guān)基因響應(yīng)該激素的刺激而降低各自表達(dá)水平，Burs-β的沉默能夠顯著抑制棉鈴蟲幼蟲體內(nèi)部分免疫相關(guān)基因的表達(dá)。