李 慧，劉保軍，吳 瓊，郭慶元

(新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】我國既是棉花的生產(chǎn)大國，同時也是棉花的消費大國。新疆已成為我國最大的棉花生產(chǎn)基地[1]。發(fā)展棉花生產(chǎn)，提高棉花產(chǎn)量一直是新疆區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展的重點，同時也是增加農(nóng)民收入，促進農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重點產(chǎn)業(yè)[2]。目前新疆棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展重點是提質(zhì)、增效、雙減。但在棉花的種植過程中遇到多種病害的侵擾，對棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了極大的影響，同時帶來化學農(nóng)藥的過量使用。依據(jù)多年的調(diào)查和相關(guān)報道新疆棉區(qū)常年實施防治的主要棉花病害為土傳性病害，包括棉花立枯病、紅腐病、枯萎病和黃萎病等。這些遍布我國廣大棉區(qū)病害的常年發(fā)生導致棉花每年損失皮棉約36×104t，價值70×108元，并顯著影響到棉花纖維質(zhì)量[3]。【前人研究進展】目前針對這些病害主要防治措施是以使用化學農(nóng)藥為主的種子處理和種子包衣。此措施的普遍實施對上述病害，尤其是苗期立枯病和紅腐病的起到了很好的控制作用[4]。但也帶來對特定化學農(nóng)藥的依賴和可能出現(xiàn)抗藥性的問題。摸索替代農(nóng)藥的方法和技術(shù)，采用生物技術(shù)手段開展防病實踐的試驗性工作正在大力開展[5、6]。以生物技術(shù)手段防治農(nóng)田有害生物的措施正大量應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，成為人類依靠科技進步向病蟲草害做斗爭的重要措施之一[7]。包括以菌抑病，如生防鏈霉菌對棉花黃萎病的防治等[8、9]。以及抗生素和植物源農(nóng)藥的利用，如：阿維菌素、苦參堿等。戴寶生[10]曾研究得出乙蒜素在稀釋倍數(shù)為1 500倍時，對棉花黃萎病防效達38.65%，10×108/g的枯草芽孢桿菌在稀釋倍數(shù)為100倍時，對棉花黃萎病防效達65.65%。這些技術(shù)措施主要利用了生物物種間的相互關(guān)系，以一種或一類生物抑制另一種或另一類生物；最大優(yōu)點是不污染環(huán)境，是替代化學農(nóng)藥防治，減少農(nóng)藥殘留，保護環(huán)境的重要方法[11-13]。【本研究切入點】當前針對棉花苗期病害，普遍采用了化學農(nóng)藥包衣，病害得到一定的控制。隨著化學農(nóng)藥減施增效政策的實施與推進，枯草芽孢桿菌類生防制劑正在許多作物病害防治上開展研究與示范，乙蒜素在許多防病試驗包括在棉花苗期病害大田示范上均取得良好效果。研究幾種針對棉花苗期病害的生防制劑防病效果及其防病增產(chǎn)效益?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選擇3種有一定應用基礎的生物性制劑為材料，通過對立枯病菌和紅腐病菌的毒力測定、對出苗率的影響及種子處理后的室內(nèi)和田間試驗，分析比較各自的防病效果和田間防病增產(chǎn)效果和效益，篩選替代化學農(nóng)藥的制劑。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

供試菌株均是從新疆棉花病樣中分離、純化得到的，經(jīng)過致病力測定后確定為致病力較強的菌株，編號分別為RHBBT、RSWXD、RJHBBT的3個引起立枯病的立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)菌株和編號分別為FBYL15-111、FKYPH15-111、FKYC15-111的3個引起紅腐病的擬輪枝鐮孢霉(Fusariumverticillioides)菌株，6個菌株均由新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理實驗室提供。

1.1.2 供試棉花品種

供試菌株為適合新疆北部種植的早熟品種新陸早46號。

1.1.3 供試制劑

因市面生防制劑流通供應品種稀少，選擇市場所有的幾種生防制劑，分別為100×108/g枯草芽孢桿菌和80%乙蒜素[14-16]，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白。表1

表1 供試制劑Table 1 Test pesticides

1.2 方 法

1.2.1 接 種

使用麥粒接種法人工接種致病菌[17]。選用新鮮成熟無破損的麥粒挑除雜質(zhì)，清洗干凈在清水中浸泡10～15 h，再次清洗后蒸熟，不破粒即可，撈出后冷卻以每瓶100 g裝入250 mL的錐形瓶中，每瓶加入10%葡萄糖液2 mL，放入122℃高壓滅菌鍋中60～90 min；采用打孔器從培養(yǎng)好的立枯絲核菌和尖孢鐮孢霉6個菌株上打取菌餅，每個錐形瓶中放入4個菌餅在25℃下進行單一菌株的接種培養(yǎng)，6 d后搖晃菌種瓶，加快發(fā)菌速度。

1.2.2 試驗設計1.2.2.1 室內(nèi)毒力試驗

參照制劑推薦使用濃度的中濃度對3種制劑設置5個濃度梯度，并分別制成含有不同濃度制劑的平板培養(yǎng)基。其中80%乙蒜素設置濃度為0.4、0.2、0.1、0.05和0.025 mg/L；100×108/g枯草芽孢桿菌設置濃度為1、0.5、0.25、0.125和0.062 5 mg/L；24%植物免疫增產(chǎn)蛋白設置濃度為32、16、8、4和2 mg/L。每種制劑接種3個菌株，每菌株重復3次，以不加制劑處理作為對照，25℃恒溫培養(yǎng)7 d，測量各處理各重復菌落直徑，分別統(tǒng)計各制劑各濃度下對棉花立枯病和紅腐病的抑制率。

1.2.2.2 室內(nèi)盆栽試驗

首先將接種好的立枯絲核菌和尖孢鐮孢霉致病菌用無菌土分別稀釋至菌土比0.04%和0.05%進行單一接種試驗，在菌土比不變的情況下將2種致病菌混合稀釋進行混合接種試驗。根據(jù)制劑推薦使用量和多次預試驗的基礎上設置24%植物免疫增產(chǎn)蛋白、80%乙蒜素、100×108/g枯草芽孢桿菌拌種濃度為100倍(10 g/L)、300倍(3.3 g/L)、500倍(2.0 g/L)、700倍(1.4 g/L)、900倍(1.1 g/L)5個濃度梯度，按制劑與種子質(zhì)量比1∶80進行拌種以不拌種作為對照試驗，其中每個處理3個重復。選用直徑為10 cm的小花盆，以每盆20粒種子進行栽種。7 d后統(tǒng)計出苗情況，并定苗，三葉期時統(tǒng)計病害發(fā)生情況。

1.2.2.3 田間小區(qū)試驗

試驗地點為三坪農(nóng)場，試驗田面積為190 m2，時間為2019年5～9月。以15 m長作為一個小區(qū)，為減少田間澆水、通風、透光等多種自然因素造成試驗誤差，采用穿插法將每個處理的重復間隔開來，按照每穴2粒棉種播種，覆土。

每種生防制劑設置1個拌種處理，根據(jù)室內(nèi)接種試驗結(jié)果設置24%植物免疫增產(chǎn)蛋白拌種濃度為500倍，80%乙蒜素拌種濃度為300倍，100×108/g枯草芽孢桿菌拌種濃度為500倍，以不拌種作為對照處理，每個處理設置3個重復，并在子葉期、一葉期、三葉期、六葉期、蕾鈴期5個階段分別調(diào)查統(tǒng)計病害發(fā)生情況。

病情指數(shù)(%)=

病害防效=

1.2.3 病情分級標準

參考潘月敏[18]建立的紅腐病和龔雙軍等[19]建立的立枯病情分級標準，建立2種病單獨發(fā)生或混合發(fā)生情況下通用的分級標準。表2

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)制劑有效成分濃度( mg/L)的對數(shù)值為自變量(x)，抑制率機率值為因變量(y)，運用SPSS計算出各制劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R)和EC50。

表2 棉花紅腐病和立枯病的病情分級標準Table 2 The classification standard of cotton Fusarium red rot and Rhizoctonia damping off

2 結(jié)果與分析

2.1 3種生防制劑對棉花立枯病菌和紅腐病菌的毒力

研究表明，80%乙蒜素對棉花立枯病和紅腐病菌抑制中濃度最低，對立枯病菌時EC50為0.134 mg/L，對紅腐病菌時EC50僅為0.122 mg/L；100×108/g枯草芽孢桿菌對2種病原菌的抑制中濃度次之，對紅腐病菌時EC50為1.524 mg/L，對立枯病菌時EC50為1.904 mg/L；24%植物免疫增產(chǎn)蛋白抑制中濃度最大，對紅腐病菌時EC50為6 088.126 mg/L,對立枯病菌時EC50為35 147.087 mg/L。80%乙蒜素對棉花立枯病菌和紅腐病菌的毒力優(yōu)于100×108/g枯草芽孢桿菌，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白對棉花立枯病菌和紅腐病菌毒力極小。表3

表3 3種生防制劑對立枯絲核菌和擬輪枝鐮孢霉的抑制效果比較Table 3 Comparison of inhibitory effects of three biocontrol agents on Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum

2.2 室內(nèi)人工接菌后不同濃度3種制劑的防效比較

研究表明，3種生防制劑處理對棉花出苗均有一定的促進作用，無不利影響，三者之間差異不明顯。至三葉期時，3種生防制劑不同濃度處理均能顯著降低立枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)；3種生防制劑中80%乙蒜素效果最為明顯，病情指數(shù)在7.5%～22.8%，100×108/g枯草芽孢桿菌次之，病情指數(shù)在11.5%～26.1%，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白在3種制劑中防病作用相對較差，病情指數(shù)在17.7%～27.8%；3種制劑不同濃度間的防病作用差異明顯，均以100倍處理效果較好；其中80%乙蒜素100倍處理防效最高，達76.9%，100×108/g枯草芽孢桿菌100倍處理防效次之，防效為64.6%，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白100倍處理防效相對較低，為45.4%。3種制劑對棉花立枯病均有一定防效，但各制劑防效差異明顯，80%乙蒜素最好，100×108/g枯草芽孢桿菌次之，可在田間驗證的基礎上用于田間棉花立枯病的防治。表4，圖1，圖2

圖1 3種生防制劑不同濃度拌種處理下棉花種子出苗率變化
Fig.1 Effects of different concentrations of three biocontrol preparations on seedling emergence rate of cotton

表4 人工接菌后3種制劑不同濃度處理下的立枯病菌病情比較
Table 4 Comparison of three preparations under different concentrations of artificial exposure torhizoctoniasolanacearum

稀釋倍數(shù)(倍)Dilutionfactor濃度Concentration(g/L)病情指數(shù)(%)Diseaseindex24%植物免役增產(chǎn)蛋白Plantimmunestimulationprotein80%乙蒜素Ethylicin100×108/g枯草芽孢桿菌BacillussubtilisⅠⅡⅢ xⅠⅡⅢ xⅠⅡⅢ x1001017.320.215.617.7Aa6.78.17.77.5Aa10.214.310.011.5Aa3003.317.719.217.418.1Aa9.68.48.18.7Aa12.112.510.811.8Aa5002.016.619.418.318.1Aa7.48.58.48.1Aa11.812.711.812.1Aa7001.422.025.129.725.6Bb14.615.216.715.5Bb22.422.025.223.2Bb9001.127.129.327.027.8Bb21.327.219.922.8Cc26.225.027.126.1BcCKⅠ30.3Ⅱ35.4Ⅲ31.8平均32.5

注：表中平均一列中的不同大寫字母表示在P<0.01水平的差異顯著；不同小寫字母表示在P<0.05水平的差異顯著
Note: The difference of different uppercase letters in the average column of the table was significant atP< 0.01 level, and that of different lowercase letters was significant atP< 0.05 level

圖2 人工接菌后3種制劑不同濃度處理下棉花立枯病防效
Fig.2 Control effect of three preparations on cotton blight at different concentrations after artificial exposure

研究表明，3種生防制劑不同濃度處理均能顯著降低紅腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)；3種生防制劑中80%乙蒜素效果最為明顯，病情指數(shù)在6.2%～24.7%，100×108/g枯草芽孢桿菌次之，病情指數(shù)在11.4%～29.8%，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白在3種制劑中防病作用相對較差，病情指數(shù)在17.6%～33.2%；3種制劑不同濃度間的防病作用差異顯著，均以100倍處理效果較好；其中80%乙蒜素100倍處理防效最高，達83.9%，100×108/g枯草芽孢桿菌100倍處理防效次之，防效為70.4%，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白100倍處理防效相對較低，為54.4%。3種制劑對棉花紅腐病均有一定防效，但各制劑防效差異明顯，80%乙蒜素最好，100×108/g枯草芽孢桿菌次之，可在田間驗證的基礎上用于田間棉花紅腐病的防治。表5，圖3

表5 人工接菌后3種制劑不同濃度處理下紅腐病病情比較Table 5 Comparison of Red Rot under different concentrations of three preparations after artificial exposure

注：表中平均一列中的不同大寫字母表示在P<0.01水平的差異顯著；不同小寫字母表示在P<0.05水平的差異顯著
Note: The difference of different uppercase letters in the average column of the table was significant atP< 0.01 level, and that of different lowercase letters was significant atP< 0.05 level

圖3 室內(nèi)接菌后3種制劑不同濃度處理下棉花紅腐病防效
Fig.3 Control effect of three preparations on Cotton Red Rot under different concentrations of Indoor bacteria exposure

研究表明，3種生防制劑不同濃度處理均能顯著降低2種病害的發(fā)病率和病情指數(shù)；3種生防制劑中80%乙蒜素效果最為明顯，病情指數(shù)在7.1%～21.8%，100×108/g枯草芽孢桿菌次之，病情指數(shù)在11.4%～26.0%，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白在3種制劑中防病作用相對較差，病情指數(shù)在16.7%～27.9%；3種制劑不同濃度間的防病作用差異顯著；其中80%乙蒜素300倍處理防效最高，達79.4%，100×108/g枯草芽孢桿菌100倍處理防效次之，防效為66.6%，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白100倍處理防效相對較低，為49.8%。3種制劑對棉花立枯病和紅腐病均有一定防效，但各制劑防效差異明顯，80%乙蒜素最好，100×108/g枯草芽孢桿菌次之，可在田間驗證的基礎上用于田間棉花立枯病和紅腐病的防治。表6，圖4

研究表明，3種制劑在拌種稀釋倍數(shù)為100、300和500倍之間的防病效果無顯著性差異，除80%乙蒜素在500倍液處理時的兩病兼防效果略低外，其余均在極顯著水平上無差異。兼顧高效和最大可能減少制劑的用量，在田間試驗時80%乙蒜素選擇300～500倍液拌種比較適宜；100×108/g枯草芽孢桿菌和植物免疫增產(chǎn)蛋白均選擇500倍液拌種比較適宜。表6，圖4

表6 人工接菌后3種制劑不同濃度處理下立枯病和紅腐病的混合病情 Table 6 Mixed disease of Rhizoctonia solani and red rot under different concentrations of three agents after artificial inoculation

注：表中平均一列中的不同大寫字母表示在P<0.01水平的差異顯著；不同小寫字母表示在P<0.05水平的差異顯著
Note: The difference of different uppercase letters in the average column of the table was significant atP< 0.01 level, and that of different lowercase letters was significant atP< 0.05 level

圖4 人工接菌后3種制劑不同濃度處理下立枯病和紅腐病的兼防效果
Fig.4 Effect of different concentrations of three preparations on the control ofRhizoctoniasolani and Red Rot after artificial exposure

2.3 3種生防制劑對立枯病和紅腐病的田間兼防效果

研究表明，3種生防制劑拌種處理立枯病和紅腐病均有較不同程度的兼防效果，三葉期的防效與實驗室的結(jié)果大致一致。從子葉期至蕾鈴期，3種制劑處理后總的趨勢是以三葉期為轉(zhuǎn)折，病情在此前漸增，此后緩慢減輕，而防效在此前漸減，此后略增，變化不大。三葉期為病害發(fā)生最為重時期。對立枯病和紅腐病兩病發(fā)生高峰期(三葉期)及病情停止增長后(蕾鈴期)的田間防效統(tǒng)計表明，3種制劑之間對立枯病和紅腐病的綜合防效差異顯著，3種制劑中，防效最好的制劑是80%乙蒜素，三葉期綜合防效為62.3%，100×108/g枯草芽孢桿菌次之，三葉期綜合防效為53.8%，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白三葉期綜合防效相對較低，僅為35.6%，3種制劑至蕾鈴期的防效均與三葉期比較一致，僅略增2～4個百分點，3種制劑均有較好的持效性。表7，圖5

表7 3種生防制劑拌種處理下棉花各生育期立枯病和紅腐病的綜合防效Table 7 Comprehensive control effect of seed dressing with three biocontrol preparations on blight and Red Rot in cotton at different growth stages

圖5 3種生防制劑下立枯病和紅腐病的田間綜合防效
Fig.5 Comprehensive field control effects of three biocontrol preparations on stand blight and red rot

研究表明，3種生防劑均有一定程度的保苗增產(chǎn)作用；其中，80%乙蒜素增產(chǎn)效果最好，增幅為11.3%其次24%植物免疫增產(chǎn)蛋白和100×108/g枯草芽孢桿菌，增幅分別為10.4%和9.6%，按籽棉6元/kg計；3種生防制劑的直接增產(chǎn)效益分別為：80%乙蒜素142.2元/667 m2，24%植物免疫增產(chǎn)蛋白130.8元/667 m2，100×108/g枯草芽孢桿菌120.6元/667 m2。表8

表8 3種生防制劑拌種處理下籽棉產(chǎn)量及增產(chǎn)效果Table 8 Yield and yield increasing effect of seed cotton treated with three kinds of biocontrol preparations

3 討 論

周揚[20]對南疆棉區(qū)棉花立枯病菌和紅腐病菌種間及種內(nèi)菌株間的致病力的比較和分析認為，在對多個品種的人工接菌調(diào)查中棉花立枯病菌的致病力均高于紅腐病菌。在研究室內(nèi)接種試驗中，3種制劑對棉花立枯病單一防效均低于對棉花紅腐病單一防效，或也與病原菌致力有關(guān)。這些結(jié)果似乎說明病原菌致病力的強弱可能與其致病過程及防病效果方面存在著一定的聯(lián)系。

80%乙蒜素是我國自主研發(fā)的一種高效廣譜殺菌劑，是一種植物仿生農(nóng)藥，具有保苗、殺菌的作用，且在蔬菜和土壤中易消解[21]；在研究中也表現(xiàn)出較好的室內(nèi)、室外及病害兼防的效果，其防效是供試3種制劑中最好的；100×108/g枯草芽孢桿菌可分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長，并使菌絲發(fā)生斷裂、解體并溶解病原菌細胞壁，以致其失去擴張能力[22]，達到防病保苗增產(chǎn)的效果。24%植物免疫增產(chǎn)蛋白能明顯誘導激活植物體內(nèi)免疫系統(tǒng)，提高植物自身免疫力及抗逆能力，促進植物生長，是天然、廣譜、高效環(huán)保型綠色制劑。通過測產(chǎn)結(jié)果可知,經(jīng)過24%植物免疫增產(chǎn)蛋白拌種處理過的種子雖然防效不及100×108/g枯草芽孢桿菌理想，但最終產(chǎn)量卻優(yōu)于100×108/g枯草芽孢桿菌，說明該種制劑確實可以改善作物品質(zhì)、達到增產(chǎn)增收的效果，可以與其他生防制劑復配使用。田間試驗中3種制劑防效略低于室內(nèi)接種試驗，或因室內(nèi)環(huán)境土壤、光照、溫度、水分等都較為穩(wěn)定，有利于病害的發(fā)展，在防與不防之間差異較大，從而導致室內(nèi)防效高于田間防效。

生物防治最大的優(yōu)點是不污染環(huán)境，是農(nóng)藥等非生物防治方法所不能比擬的。對3種生防制劑進行了比較分析，初步顯示了一些生防制劑用于棉花病害生防的應用前景。但試驗缺少在相同條件下與化學農(nóng)藥處理的對比，是否能夠替代農(nóng)藥并達到生產(chǎn)所需的保苗效果，還需進一步的驗證。建議在進一步試驗、示范的基礎上，開展以80%乙蒜素和100×108/g枯草芽孢桿菌等生防制劑替代化學農(nóng)藥的應用研究。

4 結(jié) 論

供試的3種生防制劑對棉花苗期立枯病和紅腐病均有一定的防病增產(chǎn)效果:其中80%乙蒜素最佳，室內(nèi)和田間均對立枯病和紅腐病具有較好單一防病效果和兼防效果，室內(nèi)防效約為76.9%～83.9%，田間防效約62.3%～77.8%，增產(chǎn)幅度約11%；100×108/g枯草芽孢桿菌次之,室內(nèi)防效約為64.6%～70.4%，田間防效約53.8%～64.8%，增產(chǎn)幅度約9.6%；24%植物免疫增產(chǎn)蛋白防效較低但有一定的增產(chǎn)效果,室內(nèi)防效約為45.4%～54.4%，田間防效約35.6%～47.3%，增產(chǎn)幅度約10%。